可注射溫敏殼聚糖-膠原-甘油磷酸鈉水凝膠應(yīng)用于骨組織工程的初步研究.pdf

1、可注射的對pH或者溫度敏感的智能水凝膠材料,近些年來被研究者廣泛的關(guān)注.首先它可以在體外以流動(dòng)性很好的液態(tài)形式復(fù)合藥物,生長因子以及細(xì)胞等,然后以微創(chuàng)的方式,通過注射器或者內(nèi)窺鏡植入體內(nèi)的器官或者缺損部位,因溫度或者其他因素的影響,快速在原位形成凝膠,發(fā)揮其功效.
　　 殼聚糖是一種天然的多聚物,酸性環(huán)境下可以以液體形式存在,是甲殼素部分脫乙酰后的產(chǎn)物,具有天然的抗菌性和可生物降解和生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)。之前有研究者利用酸性的殼聚

2、糖溶液,與一種弱堿性物質(zhì),β-甘油磷酸鈉(beta-glycerophosphate,GP)混合,制備了一種對溫度敏感的殼聚糖/GP可注射凝膠,由于殼聚糖的結(jié)構(gòu)和糖胺聚糖相似等優(yōu)點(diǎn),此類材料被廣泛應(yīng)用于軟骨缺損,髓核再生修復(fù)等領(lǐng)域,取得了良好的效果。
　　 同時(shí)由于殼聚糖在骨組織工程研究中體現(xiàn)出的良好性能,諸如促進(jìn)成骨細(xì)胞生長等,使得殼聚糖/GP水凝膠材料被引入到骨組織工程的研究中來。但是,考慮到單一的殼聚糖被證明促成骨作用有限

3、,本研究引入了另一種被廣泛應(yīng)用的天然生物材料,Ⅰ型膠原,到殼聚糖/GP水凝膠中去。
　　 Ⅰ型膠原是一種天然的骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),同時(shí),很多實(shí)驗(yàn)證明其對促成骨細(xì)胞吸附和支持生長其著良好的作用。所以,本實(shí)驗(yàn)致力于構(gòu)建一種殼聚糖/膠原/GP為基底的復(fù)合的溫敏水凝膠支架材料.并且對它的理化性能,比如pH值、凝膠時(shí)間、滲透壓、超微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行檢測.同時(shí)著重檢測此水凝膠支架材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及牙周膜細(xì)胞的生物相容活性,觀察細(xì)胞在

4、材料中的生長以及分化特性.最后將此種材料復(fù)合犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞和人牙周膜細(xì)胞植入裸鼠皮下,觀察其在體內(nèi)的生物相容性,檢測其成骨性能,研究此殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應(yīng)用于骨組織工程的潛力,本實(shí)驗(yàn)主要由以下幾部分構(gòu)成.
　　 第一部分殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架的構(gòu)建及理化性能分析
　　 目的:構(gòu)建一種方便操作、適合作為細(xì)胞載體、理化性能好的可注射殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架.
　　 方法:按一定比例先后混合殼聚糖、

5、膠原、GP溶液,制備殼聚糖/膠原/GP水凝膠.通過倒置試管觀察流動(dòng)性記錄其凝膠時(shí)間,pH計(jì),滲透壓計(jì)等記錄其理化指標(biāo).
　　 結(jié)果:制備的殼聚糖/膠原/GP水凝膠pH值為7.09-7.21,凝膠時(shí)間約為8分鐘.其在普通培養(yǎng)液中的滲透壓為295-315mmol/kg.
　　 結(jié)論:具有生理pH和滲透壓的殼聚糖/膠原/GP水凝膠適合應(yīng)用于后續(xù)的體內(nèi),體外研究.8分鐘左右的凝膠時(shí)間也便于操作者將其作為載體,在液態(tài)下復(fù)合細(xì)胞,藥

6、物等物質(zhì),進(jìn)行后續(xù)的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn).
　　 第二部分殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架材料對BMSCs的細(xì)胞毒性檢測,細(xì)胞在支架內(nèi)超微結(jié)構(gòu)觀察,殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應(yīng)用于骨組織工程的評(píng)估
　　 目的:檢測殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)毒性,以及材料本身的成骨性能,評(píng)估其用于骨組織工程的潛力
　　 方法:1.接種一定數(shù)量的BMSCs于殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架,37度孵箱內(nèi)低糖培養(yǎng)基培養(yǎng),分別

7、于1天和7天使用live/dead細(xì)胞活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞在支架內(nèi)的活性.2.同法接種一定量細(xì)胞于支架中,一部分帶細(xì)胞支架在普通低糖培養(yǎng)基孵育三天后對細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡觀察,另一部分帶細(xì)胞支架經(jīng)成骨誘導(dǎo)28天時(shí),進(jìn)行掃描電鏡觀察.3.將預(yù)先成骨誘導(dǎo)一周的BMSCs接種于裸鼠皮下,4周后取材進(jìn)行組織學(xué)以及免疫組織化學(xué)的檢測.所有實(shí)驗(yàn)均采用殼聚糖/GP支架進(jìn)行對照.
　　 結(jié)果:1.超過95％的受試細(xì)胞依然在兩種支架中存活.2.掃描

8、電鏡下見,殼聚糖/GP支架中的細(xì)胞未充分伸展且較難與殼聚糖小球分辨,而細(xì)胞在殼聚糖/膠原/GP支架內(nèi)伸展良好,清晰可辨.在28天成骨誘導(dǎo)的BMSCs-殼聚糖/膠原/GP支架內(nèi)觀察到了數(shù)量較多的骨礦化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu).3.組織學(xué)結(jié)果顯示,BMSC-殼聚糖/膠原/GP組中觀察到了自發(fā)生成的血管以及類骨樣結(jié)構(gòu),其余組未見.
　　 結(jié)論:殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架適合骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長,支持預(yù)礦化誘導(dǎo)的細(xì)胞在支架中繼續(xù)成骨分化,有著很好的骨組

9、織工程支架材料的應(yīng)用潛力.
　　 第三部分殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架對HPLCs的生物相容性檢測,細(xì)胞支架復(fù)合材料的超微結(jié)構(gòu)觀察,殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應(yīng)用于牙周骨組織缺損修復(fù)的可行性分析
　　 目的:檢測殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架對HPLCs的細(xì)胞生物相容性,超微結(jié)構(gòu)下細(xì)胞在支架材料內(nèi)的生長,評(píng)估殼聚糖/膠原/GP水凝膠支架應(yīng)用于牙周組織工程的潛力
　　 方法:1.同實(shí)驗(yàn)二部分,檢測1,7天時(shí)細(xì)胞在材

10、料中的活性.2.同實(shí)驗(yàn)二部分,掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)下細(xì)胞在材料內(nèi)的生長與成骨分化.3.在接種細(xì)胞到材料的同時(shí),復(fù)合一定量的bmp-2于支架中,植入裸鼠皮下,兩周后取材,組織學(xué)檢測.
　　 結(jié)果:1.與BMSCs相似,同樣有超過95％的細(xì)胞在支架材料中存活.2.HPLCs在支架材料中伸展良好,經(jīng)過4周的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的支架中同樣發(fā)現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu).3.兩周的裸鼠皮下植入物組織學(xué)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的材料內(nèi)顯現(xiàn)明顯的軟骨細(xì)胞以及成骨樣