基于殼聚糖水凝膠的可注射性心肌組織工程研究.pdf

1、心肌梗死導(dǎo)致心肌細胞大量死亡,進而可能發(fā)展為心力衰竭,具有很高的發(fā)病率與死亡率,嚴重威脅人類健康。針對心肌梗死的現(xiàn)有臨床治療手段,如藥物治療,介入治療,心臟移植等,均存在著一定局限性,不能完全滿足心肌梗死治療的需求。因此,尋找新的、更為有效的心肌梗死治療方法已成為臨床上急需解決的問題之一。
　　近年來,干細胞與組織工程的興起為心肌梗死的治療帶來了新的機遇。在早期研究中,研究者將單純的干細胞移植到缺血的心肌,發(fā)現(xiàn)心臟功能在一定程度上

2、得到改善。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)單純的干細胞移植往往存在著細胞滯留率低、存活率低等問題,對心臟功能的長期改善效果并不理想。研究表明,可注射性心肌組織工程策略有望克服上述問題,近年來受到越來越多的關(guān)注,研究進展迅速。種子細胞、可注射性支架材料是可注射性心肌組織工程研究的重要組成要素。
　　在種子細胞研究方面,目前已有多種干細胞類型被用作心肌組織工程,包括多能性、定向能以及全能性的干細胞。然而,關(guān)于心肌組織工程理想的種子細胞類型研究

3、者尚未達成共識。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)是心肌組織工程研究最為廣泛的多能性干細胞之一,具有潛在的臨床應(yīng)用前景。近年來研究發(fā)現(xiàn),白色脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSC)與BMSC具有相似的性質(zhì),具有明顯的心梗修復(fù)效果,而其來源更為廣泛,細胞獲取更為簡便,在心肌梗死的治療中具有重要研究價值。心臟干細胞(CSC)是心血管譜系定向能的干細胞,也是心肌組織工程研究的重要種子細胞。傳統(tǒng)的CSC來源主要是心肌組織,顯然這一來源在研究應(yīng)用中受到很大的限制。

4、近年來的研究發(fā)現(xiàn),棕色脂肪組織CSC是心臟干細胞的新來源,具有與心臟來源CSC相似的較高心肌分化潛能,在未來心肌再生研究中具有潛在價值。然而,現(xiàn)有的棕色脂肪CSC分離方法效率較低,極大限制了當前的研究,高效分離棕色脂肪CSC方法的建立對于推動棕色脂肪CSC的研究與應(yīng)用具有重要意義。誘導(dǎo)型多能干細胞(iPSC)是一類與ESC高度相似的新型干細胞,但卻避開了ESCs面臨的倫理問題。研究已表明,iPSC移植后具有促進心梗修復(fù)的治療潛能。然而,

5、作為一種全能性的干細胞類型,致瘤性以及自身的免疫原性問題,依然是iPSC在心肌組織工程應(yīng)用中備受關(guān)注的問題,尚待進一步闡明。
　　在干細胞治療研究中,一種可靠的細胞標記方法對于細胞命運追蹤與治療效果的評價至關(guān)重要?；诮M織學(xué)的檢測方法無法實現(xiàn)對同一只動物的動態(tài)追蹤,且檢測結(jié)果易受取材偏差的影響?；跓晒馑孛?Fluc)標記的生物發(fā)光成像技術(shù)是一種非侵襲性的檢測方法,能從整體水平上對活體動物進行連續(xù)追蹤,且具有定量、實時、靈敏的優(yōu)點

6、,已廣泛應(yīng)用于干細胞與組織工程研究,對干細胞心梗移植后的命運追蹤與治療效果評價具有重要價值。
　　在支架材料方面,也已有多種可注射性支架材料成功用于心肌組織工程研究,包括天然生物材料與人工合成生物材料。過去的研究中,基于可注射性支架材料心肌組織工程研究取得了一系列進展,發(fā)現(xiàn)可注射性支架材料在干細胞移植中可能具有提高細胞滯留與存活、調(diào)控干細胞功能發(fā)揮等多重作用。然而,以往的研究對可注射性支架材料發(fā)揮作用的機制關(guān)注甚少。我們以前的研究

7、中,成功將溫敏性殼聚糖水凝膠作為ESC移植的載體應(yīng)用于可注射性心肌組織工程,并證實了其促進移植細胞滯留與存活、改善心梗微環(huán)境以及促進心梗修復(fù)的效果。然而,殼聚糖水凝膠提高移植細胞存活、改善心梗微環(huán)境及促進心梗修復(fù)效果的作用機制尚不清楚,且未見到相關(guān)報道。
　　結(jié)合可注射性心肌組織工程當前的國內(nèi)外研究進展以及存在的問題,本論文主要從以下三個方面開展相關(guān)研究工作:
　　第一部分:心肌組織工程不同種子細胞的分離、培養(yǎng)、標記及生物學(xué)

8、特性研究
　　實驗一:不同干細胞分離、培養(yǎng)與分化研究。白色脂肪與棕色脂肪分別分離自大鼠腹股溝與肩胛骨處脂肪組織;通過膠原酶與胰酶消化法分離白色脂肪ADSC并進行培養(yǎng)擴增,通過流式細胞術(shù)、多向分化等對白色脂肪ADSC進行鑒定;通過摸索膠原酶IV、DispaseII與胰酶的不同組合進行棕色脂肪CSC分離的優(yōu)化,并通過流式細胞術(shù)、成心肌分化對其進行鑒定;利用Feeder培養(yǎng)體系對iPSC進行培養(yǎng)擴增,利用抗壞血酸(Vc)誘導(dǎo)iPSC向心

9、肌細胞分化,并對抗壞血酸的最佳作用濃度進行摸索。
　　通過本部分實驗,建立白色脂肪ADSC、棕色脂肪CSC以及iPSC培養(yǎng)、分化等體系。結(jié)果表明:(1)0.1％膠原酶IV+0.1%DispaseII+0.05%胰酶消化能夠顯著提高棕色脂肪CSC的分離效率,從而建立一種基于“Cocktail”消化酶的高效分離棕色脂肪CSC的新方法;(2)抗壞血酸能夠顯著提高iPSC向心肌細胞的分化。
　　實驗二:基于慢病毒顆粒的干細胞標記研究

10、。通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞構(gòu)建攜帶熒光素酶(Fluc)、單體紅色熒光蛋白(mRFP)與胸苷激酶(tTK)三報告基因的慢病毒顆粒;利用這一慢病毒顆粒,對ADSC、iPSC進行感染標記,并對不同干細胞感染的最佳復(fù)合感染指數(shù)(MOI)進行摸索。
　　通過本部分實驗,建立了慢病毒顆粒制備體系,并掌握了利用慢病毒顆粒對不同干細胞進行標記的關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)果表明,以MOI為10-15慢病毒濃度感染ADSC效率可達70-80%;以MOI為15-2

11、0慢病毒濃度感染iPSC效率可達25-30%。
　　實驗三:iPSC致瘤性與免疫原性研究。將未分化的iPSC、誘導(dǎo)分化但未純化的iPSC來源細胞(iPSC-derivates)及iPSC來源心肌細胞(iPSC-CMs)進行裸鼠皮下移植,通過生物發(fā)光成像方法對移植細胞的存活、增殖及畸胎瘤形成規(guī)律進行動態(tài)追蹤;在免疫抑制與免疫活性的心梗小鼠模型中,分別進行心肌內(nèi)移植iPSC與iPSC-CMs,通過生物發(fā)光成像方法對移植細胞的存活、增殖

12、及排斥的規(guī)律進行動態(tài)追蹤,并結(jié)合宿主淋巴細胞浸潤的檢測對iPSC的免疫原性變化規(guī)律進行揭示。
　　裸鼠皮下移植結(jié)果表明,iPSC分化狀態(tài)對其致腫瘤性具有顯著影響,未分化iPSC具有較高的致瘤性風(fēng)險;心梗環(huán)境下移植研究結(jié)果表明,iPSC在心梗環(huán)境下移植后,隨著在心肌內(nèi)的分化與發(fā)育,其免疫原性增強,從而引起宿主免疫排斥反應(yīng)的增加。
　　第二部分:可注射性殼聚糖基水凝膠制備、生物學(xué)評價及細胞保護相關(guān)機制研究
　　實驗一:溫敏

13、性殼聚糖基水凝膠的制備與生物學(xué)評價。首先制備了溫敏性的殼聚糖水凝膠,通過與ADSC共培養(yǎng)等對其細胞相容性進行評價;在心梗環(huán)境下注射后,通過組織學(xué)染色對其組織相容性、降解性與ROS清除作用進行評價。
　　結(jié)果表明,殼聚糖基水凝膠具有良好的細胞相容性與組織相容性;在心梗微環(huán)境下,殼聚糖基水凝膠具有適當?shù)慕到馑俾?并能夠有效清除其中的ROS。
　　實驗二:殼聚糖降解產(chǎn)物在模擬ROS環(huán)境下促進ADSC黏附與存活的研究。在培養(yǎng)基中添加

14、H2O2模擬ROS環(huán)境,在這一模型下對ROS損傷ADSC的作用進行了研究。在此基礎(chǔ)上,對殼聚糖降解產(chǎn)物D-Glu與N-AC-Glu清除ROS、保護ADSC的作用機制進行了探討。
　　結(jié)果表明,ROS通過下調(diào)ADSC黏附相關(guān)蛋白的表達誘導(dǎo)ADSC損傷;D-Glu、N-AC-Glu能夠通過ROS的清除,減少環(huán)境中ROS對ADSC黏附蛋白的下調(diào)作用,促進ADSC黏附與存活,從而發(fā)揮對ADSC的保護作用。
　　第三部分:溫敏性殼聚糖

15、基水凝膠攜帶ADSC心梗移植的實驗研究
　　心梗大鼠模型隨機分成4組,分別注射100μLPBS(PBS組)、100μL殼聚糖水凝膠(Chitosan組)、100μLADSC/PBS(ADSC/PBS組)、100μLADSC/Chitosan(ADSC/Chitosan組)。移植后不同時間點,通過非侵襲性的生物發(fā)光成像方法,對ADSC的滯留與存活進行動態(tài)追蹤;通過組織學(xué)與分子生物學(xué)手段,對殼聚糖基水凝膠作用機制進行揭示;移植后4w,

16、通過心臟組織學(xué)、超聲心動圖、血流動力學(xué)等多種手段,對心梗修復(fù)的效果進行了系統(tǒng)評價。
　　結(jié)果表明,殼聚糖基水凝膠作為ADSC心梗移植的支架材料,能夠顯著提高移植細胞在心梗部位的滯留與存活;在作用機制上,殼聚糖基水凝膠主要通過清除環(huán)境中的活性氧改善心梗微環(huán)境,促進干細胞存活、歸巢與治療功能發(fā)揮,從而促進心臟功能修復(fù)。
　　綜上所述,本研究建立了白色脂肪ADSC、棕色脂肪CSC及iPSC的培養(yǎng)、分化等平臺體系,改進了棕色脂肪CS

17、C的分離方法;在此基礎(chǔ)上掌握了利用慢病毒標記不同干細胞的關(guān)鍵技術(shù);基于這一標記技術(shù)與非侵襲性成像平臺,初步揭示了iPSC體內(nèi)移植后畸胎瘤形成與免疫原性規(guī)律;更重要的是,在體外與體內(nèi)兩種模型下證實了殼聚糖基水凝膠作為ADSC心梗移植的支架材料,能夠通過清除環(huán)境中的活性氧改善心梗微環(huán)境,促進干細胞的存活、歸巢與治療功能發(fā)揮。本研究開展的不同干細胞分離、培養(yǎng)、標記與生物學(xué)特性研究,揭示的殼聚糖基水凝膠改善心梗微環(huán)境與促進心梗修復(fù)的作用機制,對