紅細(xì)胞氧化模型評(píng)價(jià)抗氧化活性的方法學(xué)研究.pdf

1、氧化溶血實(shí)驗(yàn)是一種常用的抗氧化評(píng)價(jià)方法，通過分光光度法檢測(cè)紅細(xì)胞的膜損傷破裂情況以此反映抗氧化活性。然而，氧化溶血模型在使用時(shí)受到諸多反應(yīng)條件與檢測(cè)條件的影響，使抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果存在偏差。因此，全面系統(tǒng)地研究紅細(xì)胞氧化溶血模型在方法學(xué)發(fā)展中具有重要意義。
　　在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氧化溶血實(shí)驗(yàn)存在檢測(cè)結(jié)果偏低的陰性溶血現(xiàn)象，嚴(yán)重干擾抗氧化活性的評(píng)價(jià)。為此，本文以H2O2為氧化劑建立不同氧化等級(jí)的紅細(xì)胞模型，通過聯(lián)用熒光法與分光光度法檢

2、測(cè)溶血現(xiàn)象，并設(shè)計(jì)血紅蛋白干擾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)以剖析陰性溶血現(xiàn)象的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞在氧化溶血的同時(shí)血紅蛋白也參與氧化反應(yīng)并發(fā)生降解，血紅蛋白的這一降解過程就是陰性溶血的原因。
　　為校正因氧化性溶血引起的結(jié)果偏低現(xiàn)象，以H2O2氧化血紅蛋白為模型，用ICP光譜法、熒光法分析反應(yīng)產(chǎn)物的特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血紅蛋白釋放的鐵離子與蛋白類物質(zhì)結(jié)合形成不同有機(jī)物;而血紅蛋白的熒光產(chǎn)物中含有一部分穩(wěn)定的物質(zhì)可用于校正血紅蛋白吸光度。H2O2在一定劑量范

3、圍內(nèi)氧化血紅蛋白所得的熒光數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，建立氧化溶血實(shí)驗(yàn)中血紅蛋白吸光度的校正公式:Hbactual=Abs+FI/6.436。
　　參考體內(nèi)溶血條件通過比較培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞密度等反應(yīng)條件，確定更為合理的紅細(xì)胞體外氧化體系，即培養(yǎng)基為RPMI1640，細(xì)胞密度為2×109個(gè)/mL，H2O2劑量為166.5μmol/mL，反應(yīng)時(shí)間為24h。
　　紅細(xì)胞氧化實(shí)驗(yàn)中常使用抗氧化活性物質(zhì)預(yù)培養(yǎng)的操作模式，本文為深入分析預(yù)

4、培養(yǎng)模式(R1)中包含的潛在活性途徑特將此模式拓展（R1、R2、R3），設(shè)計(jì)三種投料順序以觀察溶血、ROS、MDA、metHb等指標(biāo)在三種模式中的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和樣品組在三種模式中的評(píng)價(jià)結(jié)果確實(shí)不同。
　　基于修正的溶血檢測(cè)方法以及紅細(xì)胞氧化模型，本文評(píng)價(jià)了新合成肽IWHDC的抗氧化活性。結(jié)果表明IWHDC可直接清除H2O2，在R1、R3模式中表現(xiàn)出抗氧化溶血作用;紅外光譜結(jié)果表明蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化是本文紅細(xì)胞氧化模型發(fā)