W1對(duì)血小板ADP受體信號(hào)通路的影響及有關(guān)藥物研究.pdf

1、W1作為一個(gè)新型合成化合物，其結(jié)構(gòu)包含2-O-氯吡格雷和阿司匹林，前者為氯吡格雷在體內(nèi)的第一步氧化代謝產(chǎn)物。W1的合成理念主要基于氯吡格雷的前藥屬性，且其代謝產(chǎn)物的不穩(wěn)定性，旨在減輕或克服氯吡格雷臨床使用中存在的主要問(wèn)題。
　　氯吡格雷在臨床上廣泛應(yīng)用于抗血栓治療，其體內(nèi)活化過(guò)程需要經(jīng)過(guò)肝臟CYP450酶的兩步氧化代謝，其代謝酶的主要亞型為CYP2C19和CYP3A4。因此，氯吡格雷的藥效通常受到機(jī)體CYP450酶活性的影響，比如

2、患者出現(xiàn)上述酶活性先天不足或配伍給藥使得酶活性被抑制的情形，后者包括質(zhì)子泵抑制劑（如奧美拉唑）或降膽固醇藥物（如他汀類(lèi)藥物）等臨床常用藥物，這些因素皆可使氯吡格雷無(wú)法達(dá)到預(yù)期療效，即出現(xiàn)“氯吡格雷抵抗”現(xiàn)象，這已成為氯吡格雷最令人擔(dān)心的問(wèn)題。
　　前期的藥效學(xué)研究表明，W1具有強(qiáng)于氯吡格雷的抗血小板效應(yīng)，而且能夠明顯減輕“氯吡格雷抵抗”現(xiàn)象。本研究主要就W1的作用機(jī)制進(jìn)行分析，著重觀察其對(duì)血小板ADP受體P2Y12信號(hào)通路的影響，

3、此外，還對(duì)可能影響氯吡格雷藥效的配伍藥物奧美拉唑和辛伐他汀進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　第一部分W1對(duì)血小板ADP受體信號(hào)通路的影響。以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將動(dòng)物分為三個(gè)組:正常對(duì)照組、氯吡格雷組(10mg/kg)和W1組(3mg/kg)，氯吡格雷和W1分別以0.5％的甲基纖維素(MC)溶液充分混懸，二者均為單次給藥，采用灌胃口服途徑，正常對(duì)照組僅服用等體積的MC混懸液。各組動(dòng)物給藥后4小時(shí)，麻醉并抽取腹主動(dòng)脈血液，離心制備洗滌血

4、小板，分別用于ADP受體信號(hào)通路分子的蛋白表達(dá)檢測(cè)和血小板鋪展實(shí)驗(yàn)。在信號(hào)分子的蛋白表達(dá)檢測(cè)中，各組動(dòng)物血小板以ADP(終濃度為50μM)處理5分鐘，正常對(duì)照動(dòng)物血小板另設(shè)非ADP處理組。ADP處理完畢，提取血小板蛋白，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)磷酸化Akt、Erk蛋白以及Rap1蛋白的表達(dá)情況。在進(jìn)行血小板鋪展實(shí)驗(yàn)時(shí)，以FITC-鬼筆環(huán)肽染色血小板，在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)血小板加以觀察，通過(guò)測(cè)定單個(gè)血小板面積反映其鋪展情況。

5、Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，W1給藥組大鼠血小板的磷酸化Akt、Erk蛋白及Rap1蛋白的表達(dá)均受到抑制，氯吡格雷組可觀察到同樣的結(jié)果。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，W1及氯吡格雷給藥組大鼠血小板的面積明顯減小，表明W1可以抑制血小板在纖維蛋白原上的鋪展，阻斷了纖維蛋白原受體的活化。
　　第二部分辛伐他汀對(duì)氯吡格雷的影響。將Wistar大鼠分為三組:氯吡格雷（10 mg/kg）組、氯吡

6、格雷（10 mg/kg）+辛伐他汀(40 mg/kg)組、氯吡格雷(10 mg/kg)+辛伐他?。?0 mg/kg）組，各組均為單次灌胃口服給藥。按照第一部分的主要方法，觀察辛伐他汀配伍給藥對(duì)氯吡格雷的影響。結(jié)果表明，大鼠血小板在Akt磷酸化蛋白表達(dá)及面積變化方面，未檢測(cè)到辛伐他汀對(duì)氯吡格雷產(chǎn)生顯著影響。為進(jìn)一步分析原因，一方面，我們將辛伐他汀(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M)作用于HepG2培養(yǎng)細(xì)胞，分

7、別以Q-PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞CYP3A4在mRNA和蛋白的表達(dá)水平;另一方面，將辛伐他汀(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M)與表達(dá)人CYP450s同工酶和人CYP450s還原酶的昆蟲(chóng)細(xì)胞微粒體共同孵育，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化分析辛伐他汀對(duì)CYP3A4酶活性的影響。結(jié)果表明，辛伐他汀沒(méi)有影響到HepG2細(xì)胞CYP3A4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，對(duì)體外肝微粒體CYP3A4的酶活性亦未產(chǎn)生明顯影響。

8、　　第三部分奧美拉唑?qū)epG2細(xì)胞CYP2C19表達(dá)的影響。將奧美拉唑(0、0.1、1、10 mg/L)作用于HepG2細(xì)胞24小時(shí)，采用Q-PCR及Westernblot檢測(cè)細(xì)胞中CYP2C19的mRNA和蛋白表達(dá)。奧美拉唑(0、0.1、1、10、100 mg/L)與表達(dá)人CYP450s同工酶和人CYP450s還原酶的昆蟲(chóng)細(xì)胞的微粒體共同孵育，在體外水平上通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化分析奧美拉唑?qū)YP2C19酶活性的影響。結(jié)果顯示，在mRN

9、A及蛋白表達(dá)水平上，奧美拉唑各濃度組均抑制CYP2C19酶的表達(dá)，且具有濃度依賴性。酶活性檢測(cè)表明，當(dāng)奧美拉唑的濃度達(dá)到10 mg/L、100 mg/L時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明高濃度的奧美拉唑抑制CYP2C19酶的表達(dá)。
　　結(jié)論:W1可明顯抑制大鼠血小板Akt、Erk及Rap1的蛋白表達(dá)，而它們正是ADP受體信號(hào)通路的重要分子，提示W(wǎng)1通過(guò)作用于ADP受體發(fā)揮其抗血小板作用;在大鼠體內(nèi)未檢測(cè)到辛伐他汀對(duì)氯吡格雷產(chǎn)生明顯影響，包