GPⅡb-Ⅲa受體拮抗劑對血小板釋放反應的影響.pdf

1、實驗目的：探討GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑及鈣通道拮抗劑對血小聚集與釋放反應的影響，從信號轉導及血小板聚集的最后途徑，為血栓性疾病的防治提供理論依據(jù)。 方法：1、標本來源：20～40歲，性別不限，近一個月內未用任何藥物，排除冠心病、高血壓、糖尿病及妊娠女性等引起高凝狀態(tài)的疾病。 2、觀察指標：1)靜息血小板PAC-1(GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體)結合率和CD62P的表達率； 2)ADP(5μmol/L)誘導的PAG(M

2、)(血小板最大聚集率)、PAC-1結合率與CD62P的表達率； 3)GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑RGDS(精氨酸—甘氨酸—天氡氨酸—絲氨酸)對PAG(M)、PAC-1結合率與CD62P表達率的作用； 4)Ca2+拮抗劑Nifedipine(硝苯地平)對PAG(M)、PAC-1結合率與CD62P表達率的作用； 5)RGDS和Nifedipine對PAG(M)、PAC-1結合率與CD62P表達率的聯(lián)合效應。 3、

3、方法與原理1)血小板聚集測定經(jīng)靜脈穿刺抽取新鮮血液，用ACD液(9：1)抗凝，分離血小板并用0.1％BSA的Hepes緩沖液懸浮，在血小板懸液中分別加入不同濃度的RGDS或Nifedipine，孵育2分鐘后在TYXN-91智能血液凝聚儀上根據(jù)比濁法原理測定血小板聚集率(PAG)。以PAG(M)為觀察指標。 2)血小板膜糖蛋白CD62P和GPⅡb/Ⅲa測定ACD抗凝新鮮全血，分別加入不同濃度的RGDS或Nifedipine，孵育1

4、0min，加入ADP(5μmol/L)孵育5min，實驗組加入PAC-1：FITC，CD62P：PE、CD61：PerCP，對照組分別加入MouseIgG：PE、MouseIgM：FITC、CD61：PerCP染色，用1％甲醛溶液固定30min，24h內上機檢測。 四統(tǒng)計分析1.計量資料的描述用均數(shù)±標準差((x)±s)表示2.抑制率的計算：(空白對照值—用藥后值)/空白對照×100％3.隨機區(qū)組設計的方差分析4.析因設計的方差

5、分析5.兩變量的線性相關分析6.所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理，檢驗標準：P≤0.05有統(tǒng)計學意義 結果：1ADP誘導的血小板活化正常人，靜息狀態(tài)下的血小板PAC-1結合率和CD62P表達率分別為(0.80±0.85)％和(3.03±0.70)％；ADP(5μmol/L)激動后，血小板PAC-1結合率和CD62P表達率分別為(77.27±9.47)％和(64.09±17.60)％，PAG(M)為(82.53±6.91)

6、％。 2Nifedipine對血小板PAG(M)的作用Nifedipine可呈濃度依賴性地抑制血小板PAG，在所取(10～160μmol)內5種濃度下，每種濃度Nifedipine對PAG(M)的抑制作用，經(jīng)方差分析，有統(tǒng)計學意義，半數(shù)抑制濃度(IC50)在160μmol/L左右。 3RGDS對血小板PAG(M)作用RGDS可呈濃度依賴性地抑制血小板PAG，在所取(50～800μmol)內5種濃度下，每種濃度RGDS對P

7、AG(M)的抑制作用，經(jīng)方差分析，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，半數(shù)抑制濃度(IC50)在200μmol/L左右。 4Nifedipine和RGDS對血小板PAG(M)的聯(lián)合作用Nifedipine(160μmol)和RGDS(200μmol)對血小板PAG(M)的聯(lián)合抑制率為(62.35±15.95)％，經(jīng)析因設計的方差分析，存在交互效應(P＜0.05)。 5Nifedipine對血小板PAC-1結合率和CD62P表達

8、率的作用Nifedipine在所取(10～160μmol)內5種濃度下，每種濃度Nifedipine對PAC-1結合率和CD62P表達率均有抑制作用，經(jīng)方差分析，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，IC50均在160μmol/L左右。不同之處在于，經(jīng)多重比較分析(S-N-K法)Nifedipine呈濃度依賴性地抑制PAC-1結合率，而呈非濃度依賴性地抑制CD62P表達率。 6RGDS對血小板PAC-1結合率和CD62P表達率的作用RG

9、DS在所取(50～800μmol)內5種濃度下，每種濃度RGDS對PAC-1結合率的抑制作用，經(jīng)方差分析，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且呈濃度依賴性，IC50在200μmol/L左右；當濃度＞200μmol/L時對血小板CD62P表達率的抑制作用有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且抑制率較弱，800μmol/L時抑制率為27.31％。 7Nifedipine和RGDS對血小板PAC-1結合率和CD62P表達率的作用的聯(lián)合作用

10、 Nifedipine(160μmol)和RGDS(200μmol)對血小板PAC-1結合率的聯(lián)合抑制率為(60.15±16.35)％，經(jīng)析因設計的方差分析，存在交互效應(P＜0.05)。說明Nifedipine(160μmol/L)和RGDS(200μmol/L)對血小板PAC-1結合率的抑制作用相互加強。而二藥聯(lián)合對血小板CD62P表達率的聯(lián)合抑制率為(57.85±17.14)％，析因設計的方差分析，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，

11、不存在交互效應。 8Nifedipine對血小板PAG(M)、PAC-1結合率和CD62P表達率作用的關系相同濃度的條件下，Nifedipine對血小板PAG(M)、PAC-1結合率和CD62P表達率作用具有相關性，PAG(M)與PAC-1結合率和CD62P表達率相關(P＜0.05)，相關系數(shù)分別為0.947、0.954；PAC-1結合率和CD62P表達率相關(P＜0.05)相關系數(shù)為0.968。 9RGDS對血小板PA

12、G(M)、PAC-1結合率和CD62P表達率作用的關系相同濃度的條件下，RGDS對血小板PAG(M)、PAC-1結合率和CD62P表達率作用具有相關性。PAG(M)與PAC-1結合率和CD62P表達率相關(P＜0.05)，相關系數(shù)分別為0.992、0.976；PAC-1結合率與CD62P表達率相關(P＜0.05)相關系數(shù)為0.965。 結論：1.GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑RGDS和Ca2+拮抗劑Nifedipine能抑制ADP誘導

13、的血小板聚集，抑制作用呈濃度依賴性，隨拮抗劑濃度增加抑制作用增強；兩者對血小板聚集的抑制存在正協(xié)同作用。 2.GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑RGDS和Ca2+拮抗劑Nifedipine能抑制ADP誘導的血小板GPⅡb/Ⅲa活化，抑制作用呈濃度依賴性，隨拮抗劑濃度增加抑制作用增強；兩者對血小板GPⅡb/Ⅲa活化的抑制存在正協(xié)同作用。 3.GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑RGDS在濃度大于200μmol/L時對ADP誘導的血小板釋放反應有