高糖對(duì)血小板線粒體機(jī)能的影響.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種全身系統(tǒng)性疾病，其慢性并發(fā)癥幾乎可涉及全身各組織。一般認(rèn)為，多元醇代謝異常、終末糖化產(chǎn)物增多、蛋白激酶C激活、己糖胺通路活性增強(qiáng)是DM并發(fā)癥發(fā)生的4種主要分子機(jī)制。2001年Brownlee提出DM并發(fā)癥的共同機(jī)制學(xué)說，即線粒體損傷可能使得上述4條通路被激活，從而導(dǎo)致DM各項(xiàng)并發(fā)癥的發(fā)生。自此之后，有關(guān)DM線粒體機(jī)能的研究迅速開展起來。諸多不同部位、不同方面針對(duì)DM患者線粒體機(jī)能的

2、研究都證實(shí)了這一學(xué)說，即線粒體功能改變是DM并發(fā)癥的發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。但盡管研究眾多，其機(jī)制仍然沒有得出最終結(jié)論。
　　 DM患者血小板功能的改變?cè)贒M血管并發(fā)癥的發(fā)展中起到重要作用，然而涉及血小板線粒體機(jī)能的研究很少。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)DM患者血小板的線粒體膜電位較正常人低，但線粒體ATP含量較正常人高。膜電位是反映線粒體功能的敏感指標(biāo)，膜電位下降說明線粒體機(jī)能受到一定程度的損傷，我們考慮，線粒體膜電位下降致使合成的ATP不

3、能順利轉(zhuǎn)運(yùn)出而在線粒體內(nèi)聚積，進(jìn)而影響到整個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)。如同機(jī)體的其他部位，高血糖長(zhǎng)期作用下，血小板線粒體機(jī)能也同樣會(huì)受到損傷。
　　 血小板是無核細(xì)胞，其他細(xì)胞器完整，以血小板為對(duì)象研究線粒體機(jī)能可減少實(shí)驗(yàn)因素對(duì)核DNA的作用而帶來的干擾，更為直接的觀察實(shí)驗(yàn)因素對(duì)線粒體的作用。并且血小板取材非常方便，使用血小板作為研究對(duì)象整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)化不少。所以我們考慮對(duì)血小板線粒體進(jìn)行更進(jìn)一步的試驗(yàn)，研究體外高糖對(duì)血小板線粒體機(jī)能的影

4、響。探討是否能建立新的、快捷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從血小板線粒體本身的特性延伸到線粒體機(jī)能共性方面，探討高糖對(duì)線粒體機(jī)能的影響、分子機(jī)制，以及藥物治療效果等，為DM患者體線粒體機(jī)能的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 目的：觀察糖對(duì)Sprague Dawley(SD)大鼠體外血小板線粒體機(jī)能的影響和2型糖尿病患者血小板線粒體機(jī)能的變化，擬建立糖尿病血小板線粒體機(jī)能退變觀察模型。
　　 方法：使用流式細(xì)胞儀測(cè)量血小板線粒體膜電位(血小板△

5、Ψm)，MTT法檢測(cè)血小板活力，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)血小板計(jì)數(shù)，透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)。
　　 觀察不同濃度葡萄糖對(duì)SD大鼠(2月齡，雌雄各半，體重180～200g，共30只)血小板線粒體機(jī)能的影響：(1)采用自身對(duì)照研究，將10只SD大鼠血小板加入5、15和30mmol/L的葡萄糖溶液，比較3組血小板在37度下靜置2、24h的血小板△Ψm、血小板活力，以選擇對(duì)體外血小板影響最為明顯的葡萄糖濃度。(2)高糖組和對(duì)照組血小板分別

6、在4℃和37℃下靜置，觀察在2、6、10、24和72h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組血小板△Ψm、血小板活力和血小板數(shù)量，找出變化最明顯的時(shí)間點(diǎn)。(3)比較4℃和37℃兩個(gè)溫度下，高糖組和對(duì)照組的血小板△Ψm。
　　 對(duì)比2型DM患者和健康成人的血小板線粒體機(jī)能：(1)提取2型DM患者10人(DM組)，健康成人10人(對(duì)照組)的血小板，將兩組血小板分別在4℃和37℃下靜置，測(cè)定2h、24h的血小板△Ψm、血小板活力和血小板數(shù)量。(2)透射電鏡

7、觀察2型DM患者和健康成人的血小板線粒體結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：動(dòng)物體外血小板線粒體觀察結(jié)果：(1)血小板計(jì)數(shù)顯示，高糖組(30mmol/L)和對(duì)照組(5mmol/L)血小板在4℃放置72h后，兩組血小板數(shù)量均隨時(shí)間減少，在2、24、48、72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組血小板數(shù)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)SD大鼠血小板分別放入5、15、30mmol/L葡萄糖溶液中在37℃下靜置24h后，30mmol/L組血小板△ψm明顯高于其他2組(3.1％

8、比1.0％和0.9％，P＜0.01)。15和30mmol/L組血小板活力高于5mmol/L組(0.27±0.05和0.27±0.02比0.21±0.02，均P=0.029)(3)體外血小板線粒體膜電位隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖可見：37℃下，高糖組和對(duì)照組在24h內(nèi)血小板△Ψm下降到一定程度后趨于平緩；而置于4℃時(shí)，24h內(nèi)血小板△Ψm先下降后升高。(4)不論高糖組還是對(duì)照組，置于4℃的血小板△Ψm均高于37℃的，但只有高糖組在靜置24h后4℃

9、和37℃下的膜電位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.6％比3.1％，P=0.000)。(5)4℃下高糖組和對(duì)照組血小板活力均隨時(shí)間下降，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 DM患者和健康人體外血小板觀察結(jié)果：(1)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，DM患者和健康人血小板在體外4℃放置72h，血小板數(shù)量(×109/L)隨時(shí)間減少，至第48、72h時(shí)，DM組血小板數(shù)量明顯少于對(duì)照組(71.3±18.9比123.8±18.9，F(xiàn)=15.474，P=0.008；67.5±

10、13.2比135±10.8，F(xiàn)=62.5，P=0.000)。(2)DM患者和健康人血小板在37℃靜置24h后，兩組血小板△Ψm差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而4℃靜置24h后，糖尿病患者血小板△Ψm明顯低于健康人(5.2％比26.5％，P＜0.01)。(3)電鏡下可見，糖尿病患者血小板線粒體形態(tài)改變，胞內(nèi)糖原聚集，線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂。
　　 結(jié)論：
　　 (1)動(dòng)物體外血小板線粒體觀察結(jié)果提示，短期內(nèi)高糖可使血小板線粒體活性增