銀杏內(nèi)酯B抑制血小板活化因子受體信號通路治療卵巢癌相關(guān)機制.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷困難，病理類型復(fù)雜多樣，預(yù)后較差。雖經(jīng)積極手術(shù)及術(shù)后化療，五年生存率仍徘徊在40％左右。為了探尋卵巢癌治療新靶點，我們在前期研究的基礎(chǔ)上闡明了PAF/PAFR信號通路在卵巢癌侵襲中的作用及機制，觀察了PAFR阻斷劑銀杏內(nèi)酯B(GB)對裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用，并初步探討了GB降低攜帶BRCA1突變卵巢上皮細(xì)胞癌變風(fēng)險的相關(guān)機制，研究分以下三部分:
　　第一部分 PAF促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞

2、侵襲的相關(guān)機制
　　目的：探討PAF對PAFR陽性卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響及其相關(guān)機制。
　　方法：(1)以不同濃度的PAF處理OVCA429細(xì)胞6h后檢測環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)蛋白的表達(dá)水平，處理24h后檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)蛋白的表達(dá)水平;以100nM PAF處理OVCA432，ES-2，SKOV3-1uc及RMUG-L細(xì)胞各6h，檢測 p-CREB變化以100 nmo

3、l/L的PAF處理OVCA429細(xì)胞不同時間后檢測有絲分裂原活化蛋白激酶p38蛋白(p38 MAPK)、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、CREB及p-CREB蛋白的表達(dá)水平，上述各蛋白的表達(dá)水平均采用WesternBlot法檢測。(2)在加入PAF(100 nM)的基礎(chǔ)上，分別加入各蛋白抑制劑，即PAFR抑制劑—GB(100μM)、p-p38 MAPK抑制劑—SB203580(10μM)、CREB結(jié)合蛋白(CBP)-CR

4、EB相互作用抑制劑—217505(25μM)。實驗分為6組:PAF組、PAF+GB組、PAF+SB203580組、PAF+217505組、PAF+SB203580+217505組及空白對照組，采用Western Blot法檢測各組細(xì)胞中p-p38 MAPK、p-CREB、MMP2蛋白的表達(dá)強度。(3)Transwell法檢測上述6組處理細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果：(1)不同濃度的PAF處理后，OVCA429細(xì)胞中p-CREB、MM

5、P2蛋白的表達(dá)水平呈明顯的濃度依賴性（P＜0.001），0.1 nmol/L的PAF即可引起p-CREB、MMP2蛋白表達(dá)水平明顯升高，至100 nmol/L時達(dá)高峰;而CREB蛋白的表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)。在OVCA432、ES-2及SKOV3-1uc中可見到類似結(jié)果，但在RMUG-L細(xì)胞中未檢測到p-CREB的變化。在100 nmol/L的PAF處理不同時間后，OVCA429細(xì)胞中p38 MAPK、CREB蛋白表達(dá)水平與

6、無明顯變化(P＞0.05);而p-p38 MAPK、p-CREB蛋白表達(dá)水平明顯升高趨勢（P＜0.001），至處理6h時達(dá)高峰，隨后逐漸降低。(2)與空白對照組比較，PAF組細(xì)胞中p-p38 MAPK、p-CREB及MMP-2蛋白的表達(dá)強度明顯增強。與PAF組比較，PAF+GB組、PAF+SB203580組、PAF+SB203580+217505組細(xì)胞中p-p38 MAPK、p-CREB及MMP-2蛋白的表達(dá)強度明顯減弱，但PAF+SB

7、203580+217505組與PAF+GB組及PAF+SB203580組相比無明顯差異;PAF+217505組細(xì)胞中p-p38 MAPK、p-CREB蛋白的表達(dá)強度無明顯變化，但其MMP2蛋白的表達(dá)強度明顯減弱。(3) Transwell實驗結(jié)果提示，PAF組的穿膜細(xì)胞數(shù)最多，PAF+GB組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，PAF+ SB203580組細(xì)胞侵襲能力明顯下降，但穿膜細(xì)胞數(shù)與空白對照相比仍有統(tǒng)計學(xué)意義，而PAF+217505組細(xì)胞的侵襲力

8、顯著下降，且抑制效果優(yōu)于SB203580;而PAF+SB203580+217505組有更好的抑制PAF引起的侵襲效果，但仍弱于PAF+GB組。
　　結(jié)論：PAF促進(jìn)PAFR陽性的卵巢漿液性癌細(xì)胞的侵襲這一作用可能是通過p38MAPK激活轉(zhuǎn)錄因子CREB，進(jìn)一步上調(diào)MMP2蛋白的表達(dá)而實現(xiàn)的。抑制這一信號通路可減弱PAF所導(dǎo)致的細(xì)胞侵襲能力。
　　第二部分銀杏內(nèi)酯B治療卵巢癌體內(nèi)實驗研究
　　目的：構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔種植

9、瘤模型，動態(tài)監(jiān)測裸鼠血清PAF水平，并觀察PAFR阻斷劑GB在體內(nèi)對腫瘤的抑制作用。
　　方法：以細(xì)胞免疫熒光檢測攜帶熒光酶基因的SKOV3-1uc細(xì)胞PAFR表達(dá)情況;腹腔注射SKOV3-1ue細(xì)胞構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型;動物活體成像監(jiān)測腹腔內(nèi)腫瘤的進(jìn)展情況;分別在種植細(xì)胞前、成瘤后及治療2周后經(jīng)尾靜脈采血100μl，制備血清，以ELISA試劑盒測定血清PAF濃度。腹腔注射SKOV3-1uc細(xì)胞4周后，選取其中40只成瘤裸

10、鼠，隨機均分為4組，按以下方案治療3周:陰性對照組(DMSO):DMS0100μl/d，GB治療組:GB10 mg/d，陽性對照組(CDDP):CDDP5 mg/kg/w，GB+CDDP治療組:GB10 mg/d+CDDP5 mg/kg/w，均為腹腔注射給藥。自治療開始每隔3天活體成像一次，根據(jù)熒光強度繪制各組腫瘤生長曲線。治療結(jié)束后犧牲裸鼠，取腫瘤組織，稱重，計算抑瘤率。免疫組化檢測各組腫瘤組織中PAFR、Src、p-Src及Cycl

11、in D1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示，在SKOV3-1uc細(xì)胞上有PAFR高表達(dá);腹腔注射細(xì)胞后約4周，在裸鼠腹腔可探及彌漫分布的腫瘤組織;組織中可檢測到PAFR高表達(dá);各組裸鼠血清PAF濃度在腹腔注射癌細(xì)胞4周后明顯升高（約6倍），經(jīng)各組方案治療2周，水平無明顯改變;在各治療組，自第6天起，GB及CDDP組腫瘤生長類似(P＞0.05)，均顯著低于DMSO組(P＜0.001)，而GB+CDDP組腫瘤生長最慢，顯著

12、低于上述二組(P＜0.001);治療第3周犧牲裸鼠，各組抑瘤率分別為:GB:48％，CDDP:53.7％，GB+CDDP:78.2％;免疫組化結(jié)果顯示，各組腫瘤組織中Src表達(dá)無明顯差異，而p-Src在GB或GB+CDDP組的表達(dá)顯著低于DMSO及CDDP組，Cyclin D1在各組中的表達(dá)由弱到強依次是GB+CDDP、CDDP、GB及DMSO組。
　　結(jié)論：PAF在卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠體內(nèi)升高，PAFR阻斷劑GB在體內(nèi)可抑制腫瘤

13、生長，與CDDP聯(lián)合使用具有一定的協(xié)同作用，提示GB可作為臨床卵巢癌患者化療的輔助藥物。
　　第三部分銀杏內(nèi)酯B降低攜BRCA1突變卵巢上皮細(xì)胞癌變風(fēng)險相關(guān)研究
　　目的：利用抗體蛋白芯片的技術(shù)探討GB是否有降低BRCA1突變者患卵巢癌的風(fēng)險及相關(guān)機制。
　　方法：選擇來源于BRCA1突變患者接受預(yù)防性卵巢切除標(biāo)本所構(gòu)建的卵巢上皮細(xì)胞株HOSE636。對細(xì)胞株行核型分析了解遺傳學(xué)背景，并行外顯子測序分析該細(xì)胞的BRCA

14、1突變情況，Western Blot檢測突變BRCA1剪切蛋白的表達(dá)。HOSE636細(xì)胞以GB或DMSO持續(xù)處理7天，提取細(xì)胞總蛋白，選擇腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)抗體蛋白芯片檢測分析兩組差異表達(dá)的蛋白，共重復(fù)實驗兩次，取蛋白改變倍數(shù)的平均值。以Western Blot檢測對部分差異蛋白進(jìn)行驗證。以Pathway Studio5.0軟件進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，分析各差異蛋白在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：核型分析提示HOSE636細(xì)胞為正常

15、女性核型。外顯子測序提示該細(xì)胞存在BRCA1第11號外顯子196 del A突變，Western Blot檢測到2條分子量大約25 kDa的BRCA1蛋白剪切片段，而無正常BRCA1蛋白。經(jīng)GB治療7天后，抗體蛋白芯片結(jié)果檢測到28個上調(diào)蛋白（升高1.5-15.5倍），22個下調(diào)蛋白（降低1.5-28.3倍）。初步分析顯示，上調(diào)蛋白中的25個蛋白都具有對抗腫瘤作用，如P53蛋白，而所以的下調(diào)蛋白都與腫瘤的形成，發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如β-

16、catenin蛋白等。Pathway Studio5.0軟件分析發(fā)現(xiàn)其中45個差異蛋白可相互構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，顯示了降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展風(fēng)險，包括下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（如PU.1、paxillin、β-catenin、PLCb1、DGKq等蛋白），上調(diào)腫瘤抑制相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（如P53蛋白），增強DNA損傷修復(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（如P53、XPA、SRPK1等蛋白）。
　　結(jié)論：我們的結(jié)果表明GB對攜帶BRCA1的卵巢上皮細(xì)胞具有降低癌變的風(fēng)險，從分子生物學(xué)