動態(tài)觀察丹參酮ⅡA對血小板活化鈣信號的影響.pdf

1、目的：利用細胞成像技術實時記錄外源性血小板膜受體激動劑作用于相應的膜受體時胞內(nèi)鈣離子水平動態(tài)變化過程，觀察丹參酮ⅡA（TSN）對血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，探討TSN抗血小板活化鈣信號傳導的機制，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。
　　方法：有效分離富集血小板血漿和非活化血小板，體外觀察不同濃度TSN對血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。非活化血小板在37℃下孵育10 min，加入血小板激動劑二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、鈣離子轉運劑

2、（IMC），在電磁攪拌下記錄5 min內(nèi)血小板聚集過程。用鈣信號指示劑fura-2/AM孵育標記血小板，以波長為340、380 nm的紫外光交替激發(fā)，發(fā)射波長為510 nm的發(fā)射光由EM-CCD相機捕獲，圖像用Andor iQ2圖像分析軟件處理，主要分析340/380的熒光比值（340/380 ratio）變化量，測定不同濃度TSN作用前后血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的變化、熒光比值達峰時間等。
　　結果：
　　1.血小板聚集率測定

3、:不同濃度的TSN對ADP、ATP引發(fā)的血小板最大聚集率與陰性對照組比較具有顯著性差異有明顯的抑制作用（0.5μM TSN組除外）；在TSN各濃度組中，2μM TSN組抑制效果最明顯，與其余各實驗組比較均有顯著性差異；0.5μM TSN組抑制效果最弱，與陰性對照組比較無顯著性差異；1μM TSN組、4μM TSN組組間抑制效果統(tǒng)計無顯著性差異。
　　2.血小板胞內(nèi)鈣離子濃度測定
　　2.1血小板活力觀察：明場觀察下，陽性對照

4、組活化的血小板呈現(xiàn)碎片狀，無完整的細胞結構，無法辨認血小板胞體，無偽足；TSN組未活化的血小板有完整的細胞結構，血小板胞體類圓形，清晰可見，無偽足。熒光觀察下，陰性對照組活化血小板中心高亮區(qū)為血小板胞體，周邊絲狀物為血小板活化后變形伸出的偽足；TSN組活化血小板較陰性對照組血小板胞體中心高亮區(qū)暗，偽足較短；陽性對照組無熒光發(fā)出。
　　2.2血小板活化鈣信號測定：在測試液含鈣情況下，ADP、ATP、IMC均能誘導血小板活化，胞內(nèi)鈣離

5、子濃度顯著升高。TSN各個劑量組對血小板活化峰值變化量（鈣離子濃度）和達峰時間均有抑制作用（0.5μM TSN組除外），其中2μM TSN組抑制效果最明顯，組間差異具有統(tǒng)計學意義。0.5μM TSN組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義。使用無鈣測試液，其測定結果與使用含鈣測試液的結果一致。
　　結論：
　　1、TSN能夠抑制由ADP、ATP等誘發(fā)的血小板聚集；
　　2、TSN能夠抑制血小板的自發(fā)活化，維持血小板的活性及結構完