丹參水溶性成分——丹參多酚酸鹽對血小板活化的抑制作用及機制研究.pdf

1、丹參的有效成分為脂溶性和水溶性兩大類，在水溶性成分中，以丹酚酸B(Sal-B)（占80％以上）為主要成分的丹參多酚酸鹽，目前被臨床廣泛應用于血栓性疾病的治療，療效確切。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)其可以抑制血小板聚集率，但是具體作用機制尚不明確，我們推斷這種療效與抑制血小板活化有關，擬采用以下臨床及基礎研究進行證實，其作用機制的闡明對于丹參的臨床應用及開發(fā)新藥均具有重要意義。
　　目的:本研究觀察丹參多酚酸鹽對急性冠脈綜合癥(ACS)患者血小

2、板活化標志糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(PAC-1)、血小板P選擇素(CD62p)的影響，通過體外研究主要成分Sal-B對健康人血小板P2Y12受體后信號通路的影響，以臨床與實驗室結合的方法闡明丹參多酚酸鹽抗血小板活化的具體藥理作用部位。
　　方法:入選患者分為實驗組:標準治療基礎上加用注射用丹參多酚酸鹽組200 mg/天;對照組:標準治療組。標準治療指根據(jù)指南使用腸溶阿司匹林和氯吡格雷（首劑予以負荷量口服后，繼續(xù)以0.1 g/天和75 mg

3、/天維持）、阿托伐他汀鈣片、依諾肝素鈉等。流式細胞儀測定血小板靜息狀態(tài)以及激動劑活化后表面PAC-1、CD62p表達，觀察丹參多酚酸鹽對ACS患者血小板活化的影響。在體外，通過Sal-B與人血小板懸浮液孵育，利用激動劑凝血酶，二磷酸腺苷(ADP)，膠原蛋白(COL)，血栓素類似物U46619或花生四烯酸（AA）刺激，篩選出血小板G蛋白偶聯(lián)P2Y1、P2Y12受體后信號通路為可能作用靶點。利用熒光分光光度儀檢測Sal-B對血小板Gq蛋白偶

4、聯(lián)P2Y1受體后胞內Ca+釋放的影響;利用血管擴張刺激磷蛋白(VASP)的印跡磷酸化檢查，放射免疫法測定細胞內的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量來檢測Sal-B對Gi蛋白偶聯(lián)P2Y12受體后信號影響。ADP與P2Y12受體之間的相互作用直接利用了原子力顯微鏡(AFM)的物理方法。
　　結果:臨床研究共納入病例63人，實驗組32人，對照組31人。治療后兩組血小板基礎狀態(tài)PAC-1和CD62P的表達比例均較治療前下降，組間比較沒有顯著差異

5、;使用ADP誘導血小板活化后，實驗組血小板PAC-1表達低于對照組(47.05±10.04％比52.06±6.18％，P＜0.05)，實驗組血小板CD62P表達低于對照組（39.48±8.33％比45.04±6.68％,P＜0.01）。
　　體外實驗中，Sal-B可以阻斷由0.5 mM AA，1μMU46619，0.05 U/ml凝血酶或者2μg/mL COL誘導的血小板聚集。進一步研究發(fā)現(xiàn)Sal-B對以ADP為激動劑誘導的血小板

6、聚集有較好的抑制作用，70μM Sal-B可以抑制ADP誘導血小板聚集60％。通過對血小板G蛋白偶聯(lián)P2Y1、P2Y12受體后信號通路進行分別檢測，在螯合細胞外鈣的前提下，Sal-B不能抑制P2Y1下游細胞內Ca2+釋放，但是可以明顯增加P2Y12下游VASP的磷酸化。
　　在此研究基礎上，我們檢測了P2Y12受體下游信號分子cAMP水平的變化。結果顯示Sal-B可以逆轉激動劑ADP誘導的cAMP下降，并且減少靜息狀態(tài)下血小板胞內

7、cAMP降解，提示具有抑制磷酸二酯酶(PDE)活性的作用。血小板胞內的PDE具有降解cAMP的作用，實驗發(fā)現(xiàn)Sal-B能夠直接抑制PDE酶活性，證明Sal-B還可以通過抑制PDE酶活性，降低cAMP降解而發(fā)揮抗血小板作用。
　　原子力顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)Sal-B的加入可以直接減小ADP與P2Y12受體之間的作用力，從而直接證明Sal-B具有P2Y12受體拮抗劑的作用。
　　結論:研究結果表明在接受氯吡格雷和阿司匹林雙聯(lián)治療的AC