PEG化的哌唑嗪-量子點(diǎn)定位α18-腎上腺素受體及藥物篩選模型的建立.pdf

1、本文第一章首先闡述了在細(xì)胞、分子水平上的藥物篩選技術(shù)中常用的熒光技術(shù)。熒光技術(shù)因?yàn)槠潇`敏度高、方法簡便成為藥物的高通量及高內(nèi)涵篩選中常用的技術(shù)，其中重點(diǎn)介紹了本實(shí)驗(yàn)中涉及到的兩種技術(shù)-全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)。其次介紹了實(shí)驗(yàn)中所涉及到的腎上腺素受體，并從空間結(jié)構(gòu)方面分析了受體與配體的耦合情況。隨后對實(shí)驗(yàn)中所用到的熒光染料-量子點(diǎn)的修飾和生物共軛方面的情況進(jìn)行了詳細(xì)的介紹，特別是高分子PEG在量子點(diǎn)的修飾中發(fā)揮的重要作用，量子點(diǎn)經(jīng)過

2、修飾以后，熒光特性得到更好的改善。最后對基于經(jīng)過修飾的量子點(diǎn)探針在藥物篩選方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。
　　 本文第二章首先從腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)出發(fā)，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，從空間結(jié)構(gòu)上分析腎上腺素受體與拮抗劑Prazosin-PEG-biotin分子的耦合情況，從理論上確定PEG分子的長度，此長度時配體上所連接的量子點(diǎn)能伸出受體的空穴之外，這樣得到的Prazosin-PEG-QDs探針減少了由于量子點(diǎn)體積太大造成的空間位阻，能夠與細(xì)胞膜

3、上α1B-AR最大量的結(jié)合。另一方面，有文獻(xiàn)報(bào)道，PEG分子量超過2000時，能夠明顯的減少Q(mào)Ds的非特異性吸附，綜合考慮，確定了PEG的長度為2000，得到PEG功能化的Prazosin-PEG2000-biotin分子。用鏈霉親和素化的量子點(diǎn)(streptavidin-QDs)耦合Prazosin-PEG2000-biotin，形成Prazosin-PEG2000-QDs，然后定位了HEK293α1B-AR細(xì)胞表面的α1B-AR。實(shí)

4、驗(yàn)中我們對Prazosin-PEG2000-QDs的濃度和其與細(xì)胞的共孵育時間這兩種影響受體標(biāo)記的因素進(jìn)行了研究，確定了Prazosin-PEG2000-QDs定位HEK293細(xì)胞膜上的α1B-AR的最佳條件，而且比較了Prazosin-QDs和Prazosin-PEG2000-QDs在相同濃度下，與α1B-AR結(jié)合的速率，證實(shí)了Prazosin-PEG2000-QDs明顯能更快的結(jié)合到細(xì)胞膜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在prazosin和QDs之

5、間插入PEG2000后，可以減少量子點(diǎn)的空間位阻，大大縮短了其與細(xì)胞膜上受體結(jié)合的時間，而且很大程度上保持了膜受體和細(xì)胞的活性；同時表面沒有表達(dá)α1B-AR的陰性細(xì)胞在相同濃度的Prazosin-PEG2000-QDs和Prazosin-QDs中，明顯對前者的吸附較弱。通過這兩個明顯的變化，說明在經(jīng)過PEG2000的修飾后，量子點(diǎn)的空間位阻和非特異性吸附問題都得到了很大的改善。
　　 本文第三章中，首先通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了通過T

6、RIFM得出的Prazosin-PEG2000-QDs與細(xì)胞膜受體結(jié)合的最佳條件。同時驗(yàn)證了經(jīng)過PEG修飾的Prazosin-PEG2000-QDs與細(xì)胞膜受體結(jié)合后細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度大大高于相同條件下Prazosin-QDs處理過的細(xì)胞，而且Prazosin-PEG2000-QDs的非特異性吸附與Prazosin-QDs相比相對較少。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將通過全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法結(jié)合對三種α1-AR拮抗劑進(jìn)行了篩選，通