乳腺癌腫瘤干細胞的基因組與轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、背景:
　　腫瘤干細胞是一群具有自我更新能力的細胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)、耐藥過程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于腫瘤干細胞的來源及本質(zhì)特征存在很大爭議，目前有以下幾種觀點:第一，腫瘤細胞通過獲得某些突變成為腫瘤干細胞，從而獲得自我更新能力，也就是說腫瘤干細胞是一種可遺傳的內(nèi)在屬性。第二，腫瘤干細胞沒有明確的遺傳學(xué)變異，而是體現(xiàn)在一種轉(zhuǎn)錄組水平的可變性，即腫瘤細胞的可塑性?；诖耍菊n題擬運用基因組與轉(zhuǎn)錄組測序分析和生物信息學(xué)方法，深入

2、闡明腫瘤于細胞的特性，明確其與非腫瘤干細胞的本質(zhì)差異。
　　乳腺癌發(fā)病率高，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，是研究腫瘤干細胞的良好疾病模型，明確乳腺癌腫瘤干細胞(Breast Cancer Stem Cells，BCSCs)的特性，可以為臨床靶向BCSCs治療開辟新思路。盡管針對BCSCs的相關(guān)研究已有報道，但是BCSCs的身份特性以及促使BCSCs形成的關(guān)鍵因素仍尚不清楚。鑒于此，本研究旨在揭示BCSCs自我更新能力是否由基因組水平突變決定

3、，以及通過對比乳腺癌腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞之間的基因組與轉(zhuǎn)錄組差異探明其內(nèi)在特點，從而為研發(fā)針對BCSCs的靶向藥物提供方向，為腫瘤的精準治療提供策略。
　　方法:
　　(1)研究對象為乳腺癌細胞系（MDA-MB-231），應(yīng)用微球體連續(xù)傳代懸浮培養(yǎng)的方法富集BCSCs，并用ALDH1流式分選方法進行鑒定。
　　(2)將收集的細胞樣品進行全基因組測序(Whole Genome Sequencing，WGS)，對測序結(jié)

4、果得到的突變位點以及相關(guān)的變異頻率行滑動窗口(sliding window)分析，檢測這些位點是否存在密集分布區(qū)域（hotspot區(qū)域，即最有可能包含BCSCs特異性突變位點的區(qū)域）。
　　(3)根據(jù)突變位點的分布特征，建立統(tǒng)計學(xué)模型，應(yīng)用行程長度編碼壓縮(Run-length encoding，RLE)算法，檢測hotspot區(qū)域。
　　(4)在群體細胞水平，對前面得到的hotspot區(qū)域行靶向深度測序，深入探究靶區(qū)內(nèi)基因

5、組水平突變信息是否為BCSCs特異性攜帶。
　　(5)進行單細胞體外成球?qū)嶒?，收集單細胞來源的微球體（即BCSCs），以及不能成球的單細胞（即非乳腺癌腫瘤干細胞，non-BCSCs，NBCSCs），在單細胞水平利用單細胞全基因組擴增技術(shù)，擴增基因組信息，針對WGS中獲得的hotspot區(qū)域（命名為WHM靶區(qū)）以及數(shù)據(jù)庫中獲得的常見腫瘤熱點突變區(qū)域（命名為CHM靶區(qū)），同時進行靶向深度測序。利用二項分布檢驗，建立統(tǒng)計學(xué)模型，逐一檢測

6、每個位點的基因組差異，并進行隨機分組(permutation)，深入分析靶區(qū)內(nèi)基因組水平突變信息是否為BCSCs特異性攜帶。
　　(6)分離1000個左右的單細胞培養(yǎng)于微球體懸浮培養(yǎng)環(huán)境（1個細胞/孔），收集乳腺癌腫瘤于細胞與非腫瘤干細胞，進行單細胞水平的轉(zhuǎn)錄組測序，將兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)，以明確單細胞轉(zhuǎn)錄組水平差異是否與BCSCs表型相關(guān)。

7、　　(7)生物信息學(xué)方法篩選差異表達基因，明確BCSCs特異性高表達的(BCSCsHighly Expressed，BHE)基因，并在多次基于大量細胞的轉(zhuǎn)錄組測序中進行驗證。
　　(8)針對BEE基因，進行功能(Gene Ontology，GO)分析及STRING網(wǎng)絡(luò)富集分析，探討B(tài)HE基因的功能特征，及其作為BCSCs生物標志物的可能性。
　　(9)利用TCGA(The Cancer Genome Altas)數(shù)據(jù)庫中多種

8、腫瘤類型的大樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，探討B(tài)HE基因是否具有臨床相關(guān)性，以及其作為BCSCs標志物的可行性。
　　結(jié)果:
　　(1)大量群體細胞靶向深度測序揭示沒有BCSCs特異性攜帶突變位點的證據(jù)
　　1)ALDH1流式檢測結(jié)果顯示，在連續(xù)成球懸浮培養(yǎng)的過程中，從源生細胞(2D)至由此培養(yǎng)的第一代(SP1)、第二代(SP2)、第三代(SP3)、第四代微球體(SP4)，BCSCs的比例逐漸增高;
　　2)WGs結(jié)果

9、顯示，部分單核苷酸變異(Simple Nucleotide Variations，SNVs)的變異頻率(Variant Allele Frequency，VAF)在2D、SP1、SP4之間存在明顯差異。不同樣品間的VAF差異分析發(fā)現(xiàn)BCSCs潛在的特異性突變位點;
　　3)滑動窗口分析顯示，潛在BCSCs突變位點存在顯著的密集分布區(qū)域。進一步分析顯示，這些位點呈現(xiàn)指數(shù)分布特征，利用RLE算法，尋找出54個潛在的特異性突變位點集中分

10、布的熱點區(qū)域(hotspot);
　　4)2D、SP1、SP4靶向hotspot的深度測序顯示，在測序深度顯著升高（平均每個位點覆蓋4500×）的情況下，2D、SP1、SP4樣品間靶區(qū)所有SNV位點的VAF沒有變化，該結(jié)果表明基因組水平突變決定BCSCs表型的假設(shè)不成立，并未發(fā)現(xiàn)BCSCs攜帶特異性突變位點的證據(jù)。
　　(2)單細胞靶向測序證實乳腺癌腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞之間基因組水平無差異
　　1)單細胞水平靶向深

11、度測序結(jié)果顯示，平均測序深度為4000×?xí)r任意兩個樣品間靶區(qū)內(nèi)所有位點的堿基權(quán)重的相關(guān)系數(shù)非常高，并且相關(guān)系數(shù)在組間(BCSCs對比NBCSCs)與組內(nèi)（BCSCs對比BCSCs或者NBCSCs對比NBCSCs）比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P值=0.3786);而且任意兩個樣品間的基因組距離極?。性?.001附近），說明所有樣品間基因組水平高度相似;
　　2)針對3個BCSCs的背景堿基數(shù)目與2個NBCSCs的噪音堿基數(shù)目進行的二項分

12、布檢驗顯示，WHM靶區(qū)內(nèi)有764個位點可能與BCSCs相關(guān);
　　3)針對這5個樣品進行隨機分組結(jié)果顯示，檢測出的BCSCs相關(guān)突變位點數(shù)目與分組情況無關(guān)。隨著設(shè)定閾值從0.1逐漸降至0的過程中，真正分組與隨機組的檢測陽性位點數(shù)目均等比減少，兩者的比值呈現(xiàn)始終不變的趨勢。以上結(jié)果表明，BCSCs相關(guān)的潛在突變位點為假陽性，來源于測序噪音，BCSCs相對于NBCSCs沒有基因組水平的變異;
　　4)在CHM靶區(qū)，同樣證明BCS

13、Cs相對于NBCSCs無基因組水平變異。
　　(3)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序顯示轉(zhuǎn)錄組水平的差異決定自我更新能力
　　1)體外單細胞成球?qū)嶒烇@示只有小部分單細胞生長成為微球體，說明這部分細胞具有自我更新能力;
　　2)針對5個BCSCs與3個NBCSCs進行單細胞水平轉(zhuǎn)錄組測序(Single Cell RNA sequencing，scRNA-seq)，并將2組表達譜數(shù)據(jù)進行GSEA結(jié)果顯示，BCSCs組的表達譜相對于NBCS

14、Cs組，在“干細胞增殖調(diào)控”等干性相關(guān)功能的基因集中被顯著富集，提示單細胞轉(zhuǎn)錄組水平的差異與腫瘤干細胞表型密切相關(guān);
　　3)兩組間差異基因表達分析，篩選出74個在BCSCs中顯著高表達(BCSCs highly expressed，BHE)的基因，能夠決定BCSCs的自我更新能力。這74個基因的表達譜，在多次基于大量細胞的轉(zhuǎn)錄組測序與scRNA-seq結(jié)果之間呈現(xiàn)良好相關(guān)性，驗證了seRNA-seq的檢測結(jié)果;
　　4)在

15、鑒定出的BHE基因中包含已報道的腫瘤干細胞相關(guān)基因，如ALCAM、PKM、FASN、VEGFA、ADAM10、BCL2L1、CTGF、CTNNB1、PDLIM7、STS和SET。
　　(4)BHE基因可以作為BCSCs潛在的生物標志物
　　1)BHE基因的功能(Gene Ontology，GO)分析顯示，BHE基因與胚胎發(fā)育、上皮細胞的遷移和細胞遷移的正向調(diào)控等功能顯著相關(guān);
　　2)功能網(wǎng)絡(luò)富集分析顯示BHE基因在生

16、物功能上具有相關(guān)性與協(xié)同性，如細胞生物學(xué)過程的正向調(diào)控（假陽性率:0.00295）和細胞表面受體信號通路（假陽性率:0.0034）;
　　3)TCGA數(shù)據(jù)庫中多種腫瘤類型的大樣本患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，大部分BHE基因在癌與癌旁組織中呈現(xiàn)顯著差異表達的趨勢，具有臨床相關(guān)性，可以作為BCSCs的生物標志物;
　　4)SurvExpress數(shù)據(jù)庫進行1561名乳腺癌患者預(yù)后生存分析結(jié)果顯示，大部分BHE基因在乳腺癌復(fù)發(fā)高危組患者

17、中呈現(xiàn)顯著高表達狀態(tài);
　　5)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫逐一進行BHE基因的生存分析顯示，大部分基因與乳腺癌的不良預(yù)后呈現(xiàn)顯著相關(guān)性;
　　6)PRECOG數(shù)據(jù)庫評估BHE基因在不同腫瘤類型中的預(yù)后相關(guān)性，結(jié)果顯示BHE基因?qū)τ谏窠?jīng)母細胞瘤的預(yù)后影響最大。
　　結(jié)論:
　　(1)在全基因組范圍內(nèi)，乳腺癌腫瘤干細胞相對于非腫瘤干細胞未攜帶特異性突變。
　　(2)BCSCs的身份特性及表型