膽道腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及基因組擴(kuò)增.pdf

1、目的：循環(huán)腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因其對(duì)腫瘤的早期診斷、臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷、開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值，近年來(lái)受到研究者的廣泛重視。由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)創(chuàng)傷小，簡(jiǎn)便易行，又便于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，該檢測(cè)技術(shù)常被稱為“液體活檢”。目前已經(jīng)有多種富集、分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的方法相繼出現(xiàn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲、計(jì)數(shù)及下游分析也已應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等研究中。、膽道腫瘤包括膽

2、囊癌和膽管癌，是一類侵襲性強(qiáng)、惡性度高的疾病，因其在臨床上診斷、治療困難，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。然而，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)膽道腫瘤患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的系統(tǒng)性研究。、目前，人們對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究除了聚焦于計(jì)數(shù)與臨床分期、預(yù)后的相關(guān)性以外，還試圖通過(guò)體外獲取單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組及擴(kuò)增技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)下游一系列分子水平研究做準(zhǔn)備，諸如：數(shù)字 PCR、基因組測(cè)序等。本研究中對(duì)該技術(shù)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，為穩(wěn)定獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞單細(xì)胞基因

3、組及其擴(kuò)增產(chǎn)物，從而進(jìn)行臨床耐藥相關(guān)位點(diǎn)分析、開(kāi)展疾病轉(zhuǎn)歸動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、研究腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程相關(guān)分子變化腫瘤的異質(zhì)性研究提供了前提。
　　方法：⑴選取臨床樣本，根據(jù)預(yù)設(shè)的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)選擇入組病人，根據(jù)手術(shù)情況（是否行根治性切除）及術(shù)后病理決定循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的次數(shù)和時(shí)間點(diǎn)，并制定隨訪方案。⑵征得患者或其家屬知情同意后，利用GILUPI公司研制的循環(huán)腫瘤細(xì)胞探針從外周血（肘靜脈）捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞。⑶經(jīng)過(guò)對(duì)GILUPI探針上捕獲細(xì)胞

4、的洗滌、固定、穿孔、封閉步驟后，利用多種熒光直標(biāo)的單克隆抗體，包括：上皮細(xì)胞粘附分子抗體,細(xì)胞角蛋白抗體，CD45，以及Hoechst33342對(duì)探針上粘附的細(xì)胞進(jìn)行染色。⑷在熒光顯微鏡下利用不同濾光片通道對(duì)探針上的細(xì)胞進(jìn)行觀察、拍照、鑒定，對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)鑒定為循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。⑸統(tǒng)計(jì)分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)與患者腫瘤分期、分型、疾病進(jìn)展與預(yù)后之間的關(guān)系，探討計(jì)數(shù)結(jié)果的臨床意義與價(jià)值。⑹探索多種富集、分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞后體外基因組獲取擴(kuò)

5、增技術(shù)，包括顯微切割、單細(xì)胞毛細(xì)玻璃纖維管顯微操作、DEPArray非均勻電場(chǎng)細(xì)胞操作系統(tǒng)等。
　　結(jié)果：①膽道惡性腫瘤組織中上皮細(xì)胞粘附分子多為高度-中度表達(dá)。②通過(guò)將GILUPI探針置入肘部靜脈30分鐘，能夠捕獲到部分膽道惡性腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)對(duì)附著于探針上的細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定和計(jì)數(shù)。并且這一臨床操作基本安全，本研究中未出現(xiàn)并發(fā)癥和不良反應(yīng)。③將檢測(cè)臨界值設(shè)定為2：以檢測(cè)到的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)大于或等

6、于2個(gè)定義為陽(yáng)性，小于2個(gè)為陰性。在此設(shè)定下，膽道惡性腫瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為52.5％，計(jì)數(shù)結(jié)果為2.95±3.78；膽道良性疾病患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為11%，計(jì)數(shù)結(jié)果為0.56±1.33個(gè)。④膽道惡性腫瘤患者I、II、III、IV期循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為：1.30±1.57個(gè)，2.00±2.88個(gè)，6.38±4.60個(gè)，12個(gè)；檢出率分別為40%，43%，88%，1/1。⑤91%的膽道惡性腫瘤患者在行根治性切除手術(shù)后，復(fù)查外周

7、血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)較術(shù)前檢測(cè)值下降。⑥循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)對(duì)肝膽惡性腫瘤區(qū)別于良性疾病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95.5%。⑦密度梯度離心法、帶孔濾膜加壓過(guò)濾-截留法，利用毛細(xì)玻璃纖維管顯微操作技術(shù)、顯微切割紅外粘取技術(shù)、非均勻電場(chǎng)單細(xì)胞操作技術(shù)在對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集分離和單細(xì)胞精細(xì)操作方面各有特點(diǎn)，能滿足不同類型的實(shí)驗(yàn)需求。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求綜合運(yùn)用各種技術(shù)平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高通量、精準(zhǔn)、便捷、無(wú)損操作。⑧利用REPLI-g Single Ce

8、ll Kit可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組的獲取和擴(kuò)增。
　　結(jié)論：⑴相比于良性疾病患者，膽道惡性腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯升高，計(jì)數(shù)結(jié)果也較多，兩組病人之間上述兩個(gè)指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑵膽道惡性腫瘤分期與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)性。⑶循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)在對(duì)病程動(dòng)態(tài)檢測(cè)中可以發(fā)揮重要作用。⑷對(duì)于膽囊占位性病變，術(shù)前檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能有助于對(duì)膽囊黃色肉芽腫性炎和膽囊癌的鑒別。⑸根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求綜合運(yùn)用各種技術(shù)平