腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)及腫瘤細(xì)胞檢測(cè)新方法研究.pdf

1、癌癥(cancer),又稱作惡性腫瘤(malignanttumor),是人類健康最險(xiǎn)惡的敵人之一,惡性腫瘤細(xì)胞一旦形成,其正常的細(xì)胞凋亡機(jī)制將發(fā)生重要的變化,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖,腫瘤細(xì)胞不斷地侵蝕到患者全身的各個(gè)器官時(shí),就會(huì)產(chǎn)生毀滅性的影響,全世界每年都有許多人因?yàn)樯砘几鞣N癌癥而去世。一方面,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(apoptosis)是現(xiàn)在治療癌癥的一種重要的方法,細(xì)胞凋亡被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的一種有特色的、重要的模式,細(xì)胞程序

2、性死亡是基因決定的細(xì)胞減少。細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老過程中正常發(fā)生,并且作為一種平衡機(jī)制來維持組織中細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞凋亡是通過一種多點(diǎn)緊密調(diào)節(jié)的復(fù)雜信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的,因此有很多的機(jī)會(huì)能夠評(píng)價(jià)所涉及蛋白的活性。然而,同樣重要且值得一提的是,已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞程序性死亡的其它形式,而且預(yù)計(jì)將發(fā)現(xiàn)更多種其它形式。對(duì)凋亡的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),可以判定治療效果以及預(yù)后,是癌癥治療當(dāng)中非常重要的一部分。另一方面,如果能夠在早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)癌癥,就能及早

3、治療,提高患者的存活率,因此需要開發(fā)更好的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法。核酸適體(aptamer)的出現(xiàn),為腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法發(fā)展,提供了千載難逢的機(jī)會(huì)。
　　本論文主要對(duì)惡性白血病細(xì)胞的凋亡檢測(cè)開展了一系列研究,另外,也開發(fā)了一種新的白血病細(xì)胞檢測(cè)方法,取得了一些很有價(jià)值的成果。本論文的主要研究工作如下:
　　1.構(gòu)建了一種基于金納米粒子非共價(jià)交聯(lián)變色的比色方法用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。半胱天冬酶家族(caspases)中的caspase–3

4、是細(xì)胞凋亡早期一種非常重要的物質(zhì),它能特異性地識(shí)別含有天冬氨酸–谷氨酸–纈氨酸–天冬氨酸(Asp–Glu–Val–Asp,DEVD)序列氨基酸的多肽,并在碳端的天冬氨酸后選擇性地切斷多肽。基于此,我們?cè)O(shè)計(jì)了一條含有DEVD的多肽序列Ac–Gly–Asp–Glu–Val–Asp–Cys–Cys–Arg–NH2(GR–8)做為caspase–3的底物,在被切斷前,GR–8加入金納米粒子溶液中時(shí),能夠保持檸檬酸根離子包裹的金納米粒子(帶負(fù)電)

5、的靜電穩(wěn)定性;被caspase–3切斷后,一條含有兩個(gè)巰基并帶正電的Cys–Cys–Arg–NH2(CR–3)被釋放出來,CR–3嚴(yán)重影響了金納米粒子的靜電穩(wěn)定性,從而引起金納米粒子的聚集。通過測(cè)量金納米粒子聚集前后650nm處與520nm處的紫外-可見吸收比值(Abs650/Abs520),可以反映caspase–3的活性,而caspase–3的活性反映了細(xì)胞凋亡的情況。該方法可以用來定量檢測(cè)caspase–3活性和定性檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

6、
　　2.提出了一種基于銀增強(qiáng)金納米粒子標(biāo)記方法的新型檢測(cè)策略,用于靈敏及可視化地檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。首先通過層層自組裝的方法將膜聯(lián)蛋白(Annexin–V)修飾在金電極基底上,用以特異性捕捉早期凋亡細(xì)胞。接著,合成了一種新型的氨基苯硼酸修飾的金納米粒子(APBA–GNPs),用以標(biāo)記細(xì)胞和作為銀增強(qiáng)過程的基底。最后,采用陽極溶出伏安法(ASV)靈敏地檢測(cè)銀離子,銀離子的量反映了凋亡細(xì)胞的量。線性范圍為1×102至3.5×103個(gè)細(xì)

7、胞,檢出限達(dá)到38個(gè)凋亡細(xì)胞。另外,銀增強(qiáng)完成后,在基底表面沉積的銀顆粒達(dá)到一定量時(shí),會(huì)出現(xiàn)人眼可見的灰色或者黑色,因此可以用作可視化和類似于ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。這個(gè)方法不僅靈敏和可視,而且簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)。該方法有潛力用于診斷細(xì)胞凋亡,這對(duì)評(píng)價(jià)早期治療效果和評(píng)價(jià)病程進(jìn)展以及診斷非常重要。
　　3.構(gòu)建了一種非?？旖?、簡(jiǎn)便、無標(biāo)記的早期細(xì)胞凋亡壓電檢測(cè)方法。通過電聚合在石英晶體微天平金電極表面形成一層不溶于水或某些有機(jī)溶

8、劑的聚鄰苯二胺(Po-PD)膜,膜上有未反應(yīng)的氨基。通過戊二醛交聯(lián)將鏈霉親和素固定在Po-PD膜表面;然后,將生物素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(biotin–Annexin–V)通過親和素–生物素反應(yīng)結(jié)合在鏈霉親和素上,制得了一種新型的細(xì)胞凋亡壓電傳感器。凋亡細(xì)胞能夠與Annexin–V結(jié)合,其能夠引起的石英晶體共振頻率變化(Δf)要大于正常細(xì)胞在石英晶體表面引起的共振頻率變化,所以可以用該傳感器來區(qū)分凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞,并進(jìn)行定量。該方法檢測(cè)限可

9、以達(dá)到52個(gè)細(xì)胞。該傳感器構(gòu)造簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,一步實(shí)現(xiàn)了靶細(xì)胞的無標(biāo)記識(shí)別和檢測(cè),并且非常靈敏,可用于多種腫瘤細(xì)胞的凋亡檢測(cè)。
　　4.構(gòu)建了一個(gè)非常簡(jiǎn)便的夾心結(jié)構(gòu)的惡性白血病細(xì)胞電化學(xué)檢測(cè)平臺(tái)。該方法首先通過Au-S作用將巰基修飾的CCRF-CEM細(xì)胞特異性核酸適體sgc8c-SH修飾到電極表面并進(jìn)行位點(diǎn)封閉,修飾好的電極可以用來特異性捕獲CCRF–CEM細(xì)胞,然后在細(xì)胞表面標(biāo)記上APBA–GNPs,并且以金納米粒子做為銀增強(qiáng)過