細(xì)胞凋亡的幾種常見(jiàn)檢測(cè)方法

1、1細(xì)胞凋亡的幾種常見(jiàn)檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡的幾種常見(jiàn)檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開(kāi)來(lái)。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，下面介紹幾種用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定的方法。一、AnnexinVPI法在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細(xì)胞膜外測(cè)。磷脂結(jié)合蛋白V（AnnexinV）是一種鈣依賴(lài)性的磷脂結(jié)合蛋白，它與PS具有高度的結(jié)合力。因此，Annexin

2、V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞外測(cè)的磷脂酰絲氨酸。碘化丙啶(propidineiodidePI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。方法：1、懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC標(biāo)記的Annexi

3、nV（20ugml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ugml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入3峰，但只能代表G0G1期發(fā)生凋亡，無(wú)法觀察S期和G2期發(fā)生的細(xì)胞凋亡。而且，細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定后無(wú)法對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。Hoechst33342可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，與DNA結(jié)合，能在紫外線(xiàn)下顯示藍(lán)色熒光，而且染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。PI不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能

4、染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，PI可以穿透細(xì)胞膜使壞死細(xì)胞著色產(chǎn)生紅色熒光。Hoechst33342PI雙染后，可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。在二元直方圖上，正常細(xì)胞對(duì)Hoechst33342具有拒染性，呈弱藍(lán)色熒和弱紅色熒光（Hoechst33342PI）；凋亡細(xì)胞對(duì)Hoechst33342具有嗜染性呈強(qiáng)藍(lán)色熒光弱紅色熒光（Hoechst33342PI）；壞死細(xì)胞對(duì)PI具有嗜染性，呈弱藍(lán)色熒光＋