藥物篩選及細(xì)胞凋亡的熒光分析新方法研究.pdf

1、癌癥，又稱惡性腫瘤，作為一種嚴(yán)重危害人類健康和性命的疾病，是人類面臨的最強(qiáng)大敵人之一?；瘜W(xué)藥物能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡來(lái)治療癌癥，是臨床治療癌癥的重要方法。在研究腫瘤治療的過(guò)程中，如何快速、低成本地從成千上萬(wàn)的化合物中篩選出最安全、最有效的抗腫瘤化合物一直是研究的熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞死亡的途徑一般包括凋亡和壞死途徑，其中，凋亡途徑與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、死亡緊密相關(guān)，在人類發(fā)育及抗癌藥物的篩選中扮演著重要角色。對(duì)藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，可以

2、作為藥物篩選以及判定抗腫瘤藥物治療效果的依據(jù)，在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。目前，用于篩選抗腫瘤藥物及檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有很多，但是開發(fā)通用性好、靈敏度高、樣品需求量低的藥物篩選及細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法仍迫在眉睫。作為一種單分子檢測(cè)技術(shù)，熒光相關(guān)光譜（fluorescence correlation spectroscopy，F(xiàn)CS）技術(shù)恰好能適應(yīng)這些要求。
　　本論文以藥物篩選和凋亡細(xì)胞檢測(cè)為研究?jī)?nèi)容，利用有機(jī)熒光染料及熒光量子點(diǎn)（qu

3、antum dots，QDs）為探針，采用FCS、熒光成像和流式細(xì)胞（flow cytometry，F(xiàn)CM）等檢測(cè)技術(shù)，研究建立了藥物篩選和凋亡細(xì)胞檢測(cè)的新方法，主要的研究工作如下：
　?。?）建立了一種單分子FCS技術(shù)篩選藥物新方法。該方法是基于待篩化合物能競(jìng)爭(zhēng)性地與靶蛋白結(jié)合，并通過(guò) FCS技術(shù)高靈敏地區(qū)分游離熒光探針及熒光探針-靶蛋白復(fù)合物。首先，以蛋白激酶抑制劑篩選作為模型，分別建立了 FCS技術(shù)測(cè)定熒光探針與靶蛋白的親和

4、反應(yīng)及候選化合物與探針-靶蛋白競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的理論模型。然后設(shè)計(jì)、合成了抗腫瘤藥物達(dá)沙替尼-Alexa488熒光探針，將其用于ABL1激酶抑制劑的篩選，并系統(tǒng)性地研究了達(dá)沙替尼熒光探針與ABL1蛋白的結(jié)合及解離反應(yīng)過(guò)程，獲得探針與ABL1的平衡解離常數(shù)及解離速率分別為40 nM和1.8×10-3 S-1。最后，將建立的方法用于篩選候選藥物，評(píng)價(jià)了六種治療慢性髓細(xì)胞樣白血病藥物與ABL1蛋白的解離常數(shù)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道值基本一致。新方法的擬合相關(guān)

5、系數(shù) R2值大于0.986，擬合殘差小于0.07；利用PDMS/玻璃微孔芯片技術(shù)將樣品需求量降低到1μL，R2大于0.979，擬合殘差小于0.12。與現(xiàn)有的方法相比，我們建立的方法具有高靈敏度、通用性好、低樣品需求量的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)無(wú)需對(duì)待篩化合物或激酶進(jìn)行標(biāo)記，無(wú)需特異性底物，只需探針和靶標(biāo)蛋白，即可評(píng)價(jià)待篩化合物與靶標(biāo)分子的親和力。該藥物篩選方法有望成為高通量篩選小分子藥物的平臺(tái)。
　　（2）構(gòu)建了一種基于FCS技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的

6、新方法。我們建立的方法基于FCS技術(shù)能夠靈敏地、選擇性區(qū)分細(xì)胞凋亡后的DNA片段化程度。首先，通過(guò)內(nèi)插核酸染料SYBR Green I標(biāo)記不同的DNA marker，利用自行構(gòu)建的FCS建立了高靈敏的DNA片段檢測(cè)方法。然后以藥物力達(dá)霉素（lidamycin，LDM）來(lái)誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡，分別以提取的凋亡細(xì)胞 DNA及細(xì)胞裂解液為樣本，利用FCS檢測(cè)DNA的擴(kuò)散行為。并分別利用單組分和多組分FCS擬合模型對(duì)DNA的擴(kuò)散系數(shù)進(jìn)行擬合，擬

7、合 R2大于0.914，擬合殘差均小于0.15。DNA的擴(kuò)散系數(shù)作為非常重要的參數(shù)來(lái)區(qū)分凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著藥物誘導(dǎo)濃度的升高，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞DNA的片段化程度越顯著，DNA的擴(kuò)散時(shí)間會(huì)顯著下降。進(jìn)而將該方法成功地用于細(xì)胞裂解液中DNA片段的檢測(cè)。建立的新方法與DNA電泳及流式細(xì)胞方法的結(jié)果基本吻合。我們建立的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法靈敏度高、預(yù)處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好。由于FCS技術(shù)的共聚焦體積小于1fL，如果利用液滴陣列

8、技術(shù)能將樣品需求量降低至納升水平，此方法可以應(yīng)用于細(xì)胞凋亡的早期檢測(cè)和篩選誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡藥物中。
　　（3）基于QDs標(biāo)記膜聯(lián)蛋白（Annexin V）特異性識(shí)別凋亡細(xì)胞的原理，采用熒光成像、FCS和FCM技術(shù)，發(fā)展了原位研究細(xì)胞凋亡的新方法。將不同表面修飾的QDs與Annexin V蛋白連接，利用凝膠柱層析分離、純化連接復(fù)合物后，利用FCS及毛細(xì)管電泳表征熒光QDs探針。考察細(xì)胞對(duì)不同表面修飾QDs的非特異性吸附，篩選出與細(xì)胞膜非

9、特異性吸附較小、能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)探針，成功地應(yīng)用于流式細(xì)胞分析、熒光成像，流式細(xì)胞分析結(jié)果與市售凋亡檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果基本一致。進(jìn)而，利用FCS與掃描成像聯(lián)用系統(tǒng)（confocal laser scanning microscopy，CLSM）研究了熒光 QDs在不同細(xì)胞狀態(tài)下的擴(kuò)散行為，檢測(cè)到探針在凋亡細(xì)胞膜上的擴(kuò)散系數(shù)從0.032μm2/s到0.115μm2/s。結(jié)果表明細(xì)胞凋亡過(guò)程中熒光 QDs的擴(kuò)散系數(shù)會(huì)