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文檔簡介
1、壬基酚(nonylphenol,NP)是環(huán)境內分泌干擾物質中具有代表性的物質,且化學性質比較穩(wěn)定,易富集于沉積物中,不易降解,暴露到環(huán)境中可導致生物與人體的性激素分泌量及活性下降,精子數(shù)量減少,生殖器官異常,癌癥等疾病的發(fā)病率增加,并使生殖能力降低,后代的健康與成活率下降,同時還可能影響到各種生物的免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng),也可能導致生物基因突變等。目前壬基酚的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法聯(lián)用和高效液相色譜法、液相色譜-質譜法,
2、后來又發(fā)展成固相萃取、吹掃捕集與氣相色譜法聯(lián)用,免疫分析方法和化學發(fā)光法偶有報道。用色譜法不僅昂貴費時,而且分析過程繁瑣冗長。近年來,隨著生物技術的發(fā)展產生了許多壬基酚的生物檢測方法。生物檢測中,PCR檢測技術由于其靈敏度高,檢測限更低,受到了廣泛關注。SYBR Green I熒光定量PCR是近年來出現(xiàn)的具有高靈敏度的定量PCR方法。目前,在壬基酚檢測領域,PCR技術主要應用檢測壬基酚的雌激素效應,直接用于檢測環(huán)境樣本中壬基酚的含量的研
3、究報導較少。本文采用體外DNA結合實驗,結合外切酶消解與熒光定量PCR技術,建立一種壬基酚的熒光定量PCR檢測新方法。
壬基酚可以活化雌激素受體,使之與包含特定序列的雙鏈DNA結合,結合的DNA因受到蛋白質的保護可抵抗核酸外切酶ExonucleaseⅢ的消解而被保留下來,痕量的保留DNA可通過PCR擴增出來。根據(jù)此原理,本研究首先從魚肝臟中提取含雌激素受體的細胞溶質,與不同濃度的壬基酚結合使雌激素受體活化,形成受體-配體復
4、合物。再設計合成特異性引物序列,采用常規(guī)PCR方法擴增制備雙鏈結合DNA;使雙鏈結合DNA與受體-配體復合物反應結合后,用核酸外切酶和S1酶消解,去除未受到蛋白質保護的結合DNA。將消解后產物作為模板,進行熒光定量PCR擴增反應,從而建立Ct值與壬基酚濃度的標準曲線。同時探索最優(yōu)反應條件,并確定熒光定量PCR的最低檢測限及其結果的重復性。將該方法用于檢測實際環(huán)境樣品中壬基酚的含量,并將檢測結果同高效液相色譜法進行比較,比較兩種檢測方法的
5、不同。
本課題主要試驗結果表明:
(1)壬基酚暴露條件下,魚體內可產生較多的雌激素受體;實驗中采用羥基磷灰石微量法,將配體受體復合物純化,效果顯著,可減少PCR實驗中的非特異性擴增。采用SPR定性鑒定受體-配體復合效果,在加入壬基酚標準溶液濃度為10-8-10-2g/L范圍內,壬基酚配體濃度與受體-配體復合物的SPR響應強度之間呈線性關系。
(2)以已知拷貝數(shù)的DNA做定量標準曲線,之后根據(jù)標準
6、曲線,及不同濃度壬基酚對應的模板拷貝數(shù),得到壬基酚濃度與Ct的關系曲線,為:Ct=-1.828×log(壬基酚濃度)+11.447。分析可知,壬基酚濃度為10-8-10-2mol/L時,線性關系顯著(R2=0.99523)。確定本實驗建立的熒光定量PCR法對壬基酚的最低檢測限為10-8mol/L。
(3)高效液相色譜法檢測壬基酚及與PCR方法的比較:論文建立了高效液相色譜法的標準直線,考察了方法的檢測限并應用于實際環(huán)境樣品
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