全基因組篩選及細(xì)胞融合探討腫瘤增殖關(guān)鍵基因及轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的：腫瘤細(xì)胞過度增殖及轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的重要特征，也是腫瘤研究的重點(diǎn)和腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本課題分別以胰腺癌和黑色素瘤細(xì)胞為模型，研究抑制腫瘤細(xì)胞過度增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因及其機(jī)制。
　　 胰腺癌的發(fā)病率死亡率處于癌癥的前十位。胰腺癌確診后往往病情進(jìn)展迅速，細(xì)胞增殖速度快，死亡率高，是臨床預(yù)后最差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。本部分課題旨于通過全基因組隨機(jī)基因敲除調(diào)控技術(shù)平臺和CFSE(carboxyfluoresceins

2、uccinimidylester)增殖追蹤方法，篩選抑制腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因，為臨床腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 黑色素瘤是皮膚腫瘤的主要致死因素，其致死原因主要是黑色瘤的高轉(zhuǎn)移率，病人在確斷時往往已有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移。細(xì)胞融合是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中常見的現(xiàn)象之一，在多種腫瘤及其轉(zhuǎn)移瘤中（如乳腺癌，前列腺癌以及黑色素瘤）都可見腫瘤細(xì)胞融合及其引起的多倍體現(xiàn)象，并與疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本部分課題旨于研究黑色素瘤細(xì)胞融合后，

3、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的病理特征及轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:Ⅰ通過構(gòu)建基因搜尋載體TNO-PB和建立穩(wěn)定表達(dá)tTA并受四環(huán)素調(diào)控的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)入搜尋載體TNO-PB質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶mPB質(zhì)粒，篩選獲得全基因組范圍內(nèi)的胰腺癌隨機(jī)基因突變文庫。應(yīng)用CFSE熒光探針追蹤胰腺癌細(xì)胞增殖和流式分選方法分選增殖減慢細(xì)胞亞群。所篩選到的細(xì)胞克隆通過CFSE追蹤或四甲基偶氯唑鹽(MTT)增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證四環(huán)素介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控。
　　 Ⅱ通過建立改良植物

4、血凝素-聚乙二醇(phytohemagglutinin-polyethyleneglycol，PHA-PEG)細(xì)胞融合方法及流式分選方法成功獲得了穩(wěn)定的黑色素瘤融合細(xì)胞；流式測定黑色素瘤融合細(xì)胞DNA含量；分析黑色素融合細(xì)胞的核型及染色體數(shù)的變化；體外培養(yǎng)及細(xì)胞計數(shù)檢測融合細(xì)胞的增殖速度；小鼠皮下注射檢測腫瘤生長和尾靜脈注射檢測腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力；Affymatrix基因芯片分析差異表達(dá)的基因和Westemblot測定相關(guān)蛋白表達(dá)。

5、>　　 結(jié)果：Ⅰ構(gòu)建了TNO-PB全基因組搜尋質(zhì)粒：建立了穩(wěn)定表達(dá)tTA并受DOX調(diào)控的胰腺癌細(xì)胞株；建立了約74萬+DOX條件篩選的胰腺癌全基因組隨機(jī)突變文庫；建立了CFSE追蹤腫瘤細(xì)胞增殖的方法和流式分選增殖減慢細(xì)胞群的方法及克隆法篩選增殖減慢克隆的方法。通過以上方法成功篩選到并通過后期的驗(yàn)證確定其為受DOX調(diào)控的增殖減慢克隆，為進(jìn)一步研究腫瘤增殖減慢關(guān)鍵基因打下了基礎(chǔ)。
　　 Ⅱ成功得到了單一穩(wěn)定的黑色素融合細(xì)胞。黑色素

6、瘤融合細(xì)胞的體積和DNA含量均發(fā)生翻倍變化，染色體由多2倍體轉(zhuǎn)變?yōu)槎?倍體。體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示黑色素瘤融合細(xì)胞的體外增殖速度明顯減慢，體內(nèi)生長曲線也顯示黑色瘤融合細(xì)胞的皮下腫瘤生長速度減慢：但黑色素瘤融合細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)?；蛐酒治鼋Y(jié)果顯示黑色素瘤融合細(xì)胞與增殖相關(guān)的PI3K-AKT通路明顯下調(diào)。Westem分析驗(yàn)證融合細(xì)胞中PI3K-AKT通路下游蛋白phospho-S6表達(dá)明顯降低。提示細(xì)胞融合通過PI3K-AKT通路降低黑色素

7、瘤細(xì)胞增殖能力。基因芯片顯示與黑色素轉(zhuǎn)移相關(guān)的β-tubulin2基因表達(dá)顯著提高（＞10倍）。
　　 結(jié)論：在胰腺癌細(xì)胞模型中成功建立了約74萬+DOX條件下篩選的胰腺癌全基因組突變文庫。建立了CFSE追蹤腫瘤細(xì)胞增殖方法以及流式法分選增殖減慢細(xì)胞群、克隆法篩選增殖減慢克隆方法。成功得到了受DOX調(diào)控的胰腺癌增殖減慢克隆。為腫瘤的增殖抑制研究提供了新的研究方法。
　　 在黑色素瘤細(xì)胞模型中建立了高效的PHA-PEG細(xì)胞