肝細(xì)胞癌SuperArray腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片篩選及Cathepsin L表達(dá)實驗研究.pdf

1、肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，對肝癌的防治研究具有積極意義。近年來對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，在這一過程中有多個因素參與了轉(zhuǎn)移的調(diào)控，肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)本質(zhì)，也是肝癌治療失敗和患者致死的主要原因，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，從基因水平上入手，解決肝癌的轉(zhuǎn)移有了實現(xiàn)的可能。 基因芯片技術(shù)作為一個有力的工具應(yīng)運而生，可提供全基因組范圍的生物學(xué)研究。由于基因芯片高速度、高通量、集約化和低成本的特點，其

2、誕生以來就受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。芯片技術(shù)在疾病診斷，特別是腫瘤的判別、比較腫瘤和正常組織、鑒別組織來源、腫瘤的亞分類等基礎(chǔ)研究上具有重要作用。以前腫瘤研究方法中只針對某一單個基因進(jìn)行研究，沒有橫向比較，高密度基因芯片技術(shù)可以提供平臺進(jìn)行多種基因的橫向比較，探討在某一模型中哪些基因起關(guān)鍵作用。 本實驗以臨床轉(zhuǎn)移肝癌標(biāo)本為研究對象，通過SuperArray基因芯片技術(shù)對肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行篩選，并通過免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR和

3、免疫印跡等技術(shù)進(jìn)行臨床標(biāo)本驗證，結(jié)合患者臨床相關(guān)資料，探討篩選出的基因與患者年齡、病程、腫瘤類型、臨床分期及轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。再通過肝癌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型觀察其表達(dá)及抑制后的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平的變化及細(xì)胞侵襲力的變化。通過以上研究，探討基因芯片篩選出的肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為肝癌的臨床治療提供研究基礎(chǔ)。 主要結(jié)果及結(jié)論如下： 第一部分：肝細(xì)胞癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SuperArray基因芯片表達(dá)研究。

4、1、選取正常肝組織、未轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌組織進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)移肝癌較正常組織表達(dá)上調(diào)3倍以上的基因有33個，轉(zhuǎn)移肝癌較正常組織表達(dá)上調(diào)3倍以上的基因有50個，轉(zhuǎn)移肝癌較未轉(zhuǎn)移肝癌表達(dá)上調(diào)3倍以上的基因有13個。未轉(zhuǎn)移肝癌較正常組織表達(dá)下調(diào)3倍以上的基因有5個，轉(zhuǎn)移肝癌較正常組織表達(dá)下調(diào)3倍以上的基因有9個，轉(zhuǎn)移肝癌較未轉(zhuǎn)移肝癌表達(dá)下調(diào)3倍以上的基因有3個。 2、根據(jù)實驗結(jié)果選擇上調(diào)基因VEGF和組織

5、蛋白酶L和下調(diào)基因Kai-1和Cadherin11進(jìn)行驗證，通過RT-PCR和WB方法證實了基因芯片的檢測結(jié)果。 第二部分：肝細(xì)胞癌CathepsinL臨床表達(dá)特征及與血管生成關(guān)系 選取肝癌組織標(biāo)本58例，其中高分化18例，中分化18例，低分化22例，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期26例，Ⅲ-Ⅳ期32例，有轉(zhuǎn)移28例。免疫組化法、RT-PCR和免疫印跡法進(jìn)行CathepsinL，VEGF和CD34檢測，統(tǒng)計實驗結(jié)果。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)

6、： 1、肝癌CathepsinL表達(dá)與患者性別和年齡無相關(guān)性，與肝癌病理分級有顯著相關(guān)性，分化越低的肝癌，CathepsinL表達(dá)越強(qiáng)。 2、肝癌CathepsinL表達(dá)與肝癌臨床分期有顯著相關(guān)性，晚期肝癌CathepsinL表達(dá)強(qiáng)于早期肝癌。 3、臨床晚期肝癌中VEGF表達(dá)強(qiáng)度高于早期肝癌，低分化肝癌VEGF表達(dá)強(qiáng)度高于高中分化肝癌，肝癌CathepsinL表達(dá)強(qiáng)度變化與VEGF表達(dá)強(qiáng)度呈相同趨勢，呈正相關(guān)關(guān)系

7、。 4、肝癌不同年齡組MVD無顯著區(qū)別，肝癌臨床晚期MVD顯著高于早期肝癌，低分化肝癌MVD顯著高于高中分化肝癌。統(tǒng)計分析表明，肝癌MVD與VEGF及CathepsinL表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)。 第三部分：RNA干擾沉默CathepsinL基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞影響實驗研究 肝癌細(xì)胞分為正常對照組(正常組)、轉(zhuǎn)染對照組(對照組)和CathepsinLsiRNA轉(zhuǎn)染實驗組(轉(zhuǎn)染組)，觀察時間為轉(zhuǎn)染后1d，3d和6d。轉(zhuǎn)染組進(jìn)

8、行CathepsinLsiRNA轉(zhuǎn)染，MTI法及流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞增殖狀況，免疫熒光、RT-PCR及WB法進(jìn)行CathepsinL檢測，transwell小室法進(jìn)行細(xì)胞侵襲力測定。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、RNAi可有效沉默肝癌細(xì)胞CathepsinLmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，同時抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示CathepsinL在肝癌細(xì)胞的生長和增殖中起重要作用，是肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵性生物因子之一。