柑橘基因組進(jìn)化和果實(shí)采后轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、柑橘基因組學(xué)研究在理解基因組結(jié)構(gòu)特征及基因-性狀之間聯(lián)系等方面取得了飛速發(fā)展，并積累了大批的數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)甜橙基因組開(kāi)展了denovo測(cè)序并獲得其基因組草圖。同時(shí)高通量分析技術(shù)也是研究柑橘響應(yīng)貯藏逆境脅迫、揭示果實(shí)采后生命活動(dòng)規(guī)律的重要新興手段。本研究中，我們分別從基因組大小進(jìn)化和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式等生物學(xué)角度出發(fā)解析這些序列數(shù)據(jù)和分子生理數(shù)據(jù)的屬性特征及相互關(guān)系，主要包括了四部分內(nèi)容:(1)分析柑橘轉(zhuǎn)座元件的組成、類別、進(jìn)化模式、活性

2、和柑橘群體間的插入差異等;(2)研究全基因組復(fù)制在柑橘物種形成過(guò)程中發(fā)生的次數(shù)和時(shí)間，并通過(guò)共線性分析揭示柑橘染色體進(jìn)化機(jī)制;(3)基于基因表達(dá)譜芯片解析椪柑低溫貯藏中生理變化的主要調(diào)控元件和關(guān)鍵功能模塊;(4)從結(jié)構(gòu)、生理代謝和基因表達(dá)等水平研究采后打蠟處理對(duì)椪柑果實(shí)線粒體的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.柑橘轉(zhuǎn)座元件的注釋和進(jìn)化特征
　　(1)轉(zhuǎn)座元件在甜橙和克里曼丁橘基因組序列中分別占18.38％和20.56％。其中反轉(zhuǎn)

3、錄轉(zhuǎn)座子在全部轉(zhuǎn)座元件序列中所占的比率為95％，而DNA轉(zhuǎn)座子儀占5％。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的Copia和Gypsy類型是含量最多的轉(zhuǎn)座元件類型，分別占40％和50％左右。
　　(2)在甜橙基因組中分析得到了1331條全長(zhǎng)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，并依據(jù)序列相似度將其歸于198個(gè)Copia家族和130個(gè)Gypsy家族;在克里曼丁橘基因組中得到2394條全長(zhǎng)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座了，將其歸于213個(gè)Copia家族和99個(gè)Gypsy家族。兩個(gè)基因組中的80％反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

4、座子家族所含全長(zhǎng)序列成員數(shù)都小于5個(gè)，表明這些家族有著較低的基因組擴(kuò)增速率。而15個(gè)所含成員最多的家族分別占甜橙和克里曼丁橘基因組總序列的10％和13.9％?；赗T結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，Copia家族的擴(kuò)增有著明顯的進(jìn)化分支偏好性。
　　(3)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座予在甜橙和克里曼丁橘基因組中半衰期分別為0.67myr和0.55myr，且不同家族有著不同的擴(kuò)增高峰期。
　　(4)部分反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族仍保留轉(zhuǎn)錄活性，并在塑造柑橘不同

5、品種基因組結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了作用。
　　2.柑橘全基因組復(fù)制
　　(1)甜橙943個(gè)標(biāo)記的連鎖圖用于定位了161個(gè)denovo測(cè)序得到的scaffolds，總長(zhǎng)為239Mb，含有的基因數(shù)目為22873個(gè)。
　　(2)在甜橙染色體1-2-4，3-4-6，3-5-9，5-7-8，4-6-8，1-4-7之間檢測(cè)到同源倍增區(qū)段，對(duì)應(yīng)著1321對(duì)同源基因。這些基因的Ks分布呈正態(tài)分布特征并只含有一個(gè)峰值(Ks=1.27)，推測(cè)在柑橘基

6、因組進(jìn)化過(guò)程中只發(fā)生過(guò)古老的γ復(fù)制事件，而沒(méi)有發(fā)生新的全基因組復(fù)制。
　　(3)柑橘基因組和擬南芥、可可、蘋(píng)果、草莓、葡萄基因組共線性分析表明柑橘和可可、葡萄基因組有著較高的共線性關(guān)系，從而說(shuō)明甜橙較好地保留了古老染色體狀態(tài)。而至少發(fā)生了49次重組和融合事件后導(dǎo)致柑橘染色體從古老雙子葉祖先的X=7狀態(tài)進(jìn)化到現(xiàn)今X=9的染色體核型。
　　3.椪柑（CitrusreticulataBlanco）采后低溫貯藏轉(zhuǎn)錄組分析
　　

7、(1)椪柑表達(dá)譜芯片結(jié)果表明，低溫貯藏轉(zhuǎn)錄本中有2161個(gè)差異表達(dá)基因，包含了975個(gè)上調(diào)表達(dá)和1186個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。而表達(dá)改變主要發(fā)生在低溫貯藏60d以后。上調(diào)表達(dá)基因主要對(duì)應(yīng)了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，逆境脅迫應(yīng)答因子和激素信號(hào)等功能。
　　(2)有92個(gè)與激素相關(guān)的基因和98個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平發(fā)生了改變。其中乙烯信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)均上調(diào)，而AP2-EREBP和C2H2轉(zhuǎn)錄因子家族上調(diào)表達(dá)數(shù)日達(dá)到顯著水平。
　　(3)可溶性糖

8、（蔗糖，葡萄糖和果糖）變化模式都為貯藏前60d略有上升，而60d后下降。而相應(yīng)的蔗糖酶表達(dá)上升，淀粉水解酶表達(dá)下降。
　　4.椪柑（CitrusreticulataBlanco）采后低氧脅迫與線粒體功能的關(guān)系
　　(1)經(jīng)打蠟處理后的果實(shí)，乙醇和乙醛含量提高顯著;ATP和NADPH下降顯著;POD活性下降顯著;線粒體結(jié)構(gòu)變化明顯，表現(xiàn)為內(nèi)嵴消失，線粒體蛋白溢出等。
　　(2)對(duì)打蠟果實(shí)的代謝組分析得到50種代謝物，其中

9、有18種物質(zhì)含量變化顯著，包括有機(jī)酸，氨基酸，嘌呤，糖和糖衍生物等。
　　(3)通過(guò)同源序列法，我們獲得了400個(gè)線粒體定位蛋白，217個(gè)葉綠體定位蛋白，116個(gè)液泡定位蛋白和119個(gè)質(zhì)膜定位蛋白的相應(yīng)核苷酸序列信息，并與597柑橘轉(zhuǎn)錄因子一并設(shè)計(jì)探針，定制了一款含1569個(gè)基因的Agilent寡核苷酸芯片。
　　(4)在常溫(R)，打蠟常溫(WR)和打蠟低溫(WL)三種貯藏條件下，一共有474個(gè)差異表達(dá)基因;而這三種貯藏條

10、件對(duì)應(yīng)的差異基因數(shù)目分別為181，400和90，表明WR果實(shí)中基因表達(dá)變化最大。
　　(5)變化顯著的功能模塊中，NADH參與的ATP合成模塊、N代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等為上調(diào)表達(dá)模塊，而其余的多為下調(diào)表達(dá)功能模塊。
　　(6)在R，WR，WL貯藏條件果實(shí)中分別有68，180，70個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括了AP2-EREBP，NAC，WRKY，C2H2，MYB-related家族等;其中AP2-EREBP和HB家族的部分成員與