以脂代謝相關受體為靶點的抗動脈粥樣硬化藥物篩選及藥物作用機制研究.pdf

1、目前，心腦血管疾病是世界發(fā)病率最高的疾病之一，其致死、致殘率高居各類疾病之首。其中，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生是心腦血管疾病的主要病理基礎。脂質代謝紊亂尤其是膽固醇代澍紊亂是目前公認的主要致病因子。調脂藥物的早期研究主要集中于針對低密度脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor.LDLR)通路，他汀類藥物是其代表藥物，具有出色的降膽固醇療效，可明顯降低心臟病及卒中的風險。但是他

2、汀類藥物總的有效率僅為20～40％，因此，心血管疾病遠未解決，亟需發(fā)現新作用機制的藥物。近年來，在新型調脂藥物研發(fā)過程中，血漿脂蛋白代謝過程中的另兩個關鍵步驟：膽固醇逆向轉運(reversecholesteroltransport，RCT)通路及泡沫細胞形成(foamcellformation)過程受到越來越多的關注。本論文圍繞著這兩個方面開展了相關藥物篩選和作用機制研究。 高密度脂蛋白(highdensitylipoprote

3、in，HDL)是膽固醇逆向轉運中最主要的膽固醇攜帶者，在這一過程中，B族Ⅰ型清道夫受體SR-BI(人的同源基因命名為CLA-1)發(fā)揮了重要作用。作為HDL的受體，SR-BI參與調節(jié)肝臟對脂質的選擇性攝取，介導HDL膽閻醇酯選擇性進入細胞；另外，在外周細胞，SR-BI能通過結合HDL促進膽固醇的外流。由于SR-BI在RCT的起始及終末步驟中都發(fā)揮了重要作用，因此被認為是抗動脈粥樣硬化藥物的潛在靶點之一。本研究室構建了基于細胞的高密度脂蛋白

4、受體表達上調劑高通量篩選模型，對化合物及微生物次級代謝產物進行了大規(guī)模篩選，其中陽性菌株04-9179可有效上調CLA-1啟動子的活性，從該菌株發(fā)酵液中分離得到陽性化合物9179A及陽性組分B和C。 本論文第一部分針對CLA-1表達上調劑9179A進行結構確證，活性檢測及相關分了作用機制研究。在前期工作基礎上，經化學及生物學分析進一步確證，9179A為已知化合物TrichostatinA。檢測9179A對人肝癌細胞HepG2及小

5、鼠巨噬細胞RAW264.7中CLA-1/SR-BI表達水平的影響，結果表明9179A可分別上調HepG2及RAW264.7中CLA-1/SR-BImRNA及蛋白水平。在此基礎上，進一步檢測9179A對HepG2和RAW264.7細胞的脂質攝耿能力以及RAW264，7細胞膽固醇外流能力的影響，結果表明，9179A可上調HepG2細胞和RAW264.7細胞對DiI-HDL的攝取，還可上調RAW264.7細胞的膽固醇外流能力。對9179A分子

6、作用機制的進一步研究提示，9179A可能通過調控含有SRE/SP1等順式元件的啟動子區(qū)域發(fā)揮上調CLA-1/SR-BI轉錄的作用。此外，我們還對陽性菌株04-9179中陽性組分B和C進行了分離純化、結構鑒定和活性測定，結果表明，化合物9179B和9179C對CLA-1啟動子活性的上調作用較低。 細胞泡沫化是AS形成的關鍵步驟。巨噬細胞上存在的清道夫受體A(SR-A)和B族清道夫受體CD36可導致oxLDL被細胞無限制攝墩(即在攝

7、取時不受負反饋調控)，因此它們在泡沫細胞形成中發(fā)揮重要作用。體內、外研究顯示，60～90％的巨噬細胞泡沫化是由CD36介導的。因此CD36被認為是抗動脈粥樣硬化藥物的潛在靶點之一。 在本論文第二部分中，我們在火腸桿菌中成功表達了重組CD36可溶性受體蛋白，并以此為靶點建立了CD36拈抗劑高通量篩選模型。分別擴增人CD36全長及可溶性片段(sCD36)cDNA，將它們克隆至pGEM-T載體并測序，分別與大腸桿菌表達載體pET-30

8、a(+)連接，構建CD36及sCD36的重組表達質粒，并將重組質粒分別轉化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)，表達目的蛋白。經SDS-PAGE及WesternBlot檢測獲得成功表達sCD36的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-sCD36。該菌株表達的sCD36蛋白經配基結合實驗及油紅O染色實驗證實具有配基結合活性。隨后，利用該重組蛋白建立并優(yōu)化了基于受體.配基競爭性結合的ELISA-like高通量藥物篩選模型，并應用此模