降脂寧調(diào)節(jié)膽固醇代謝及抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、中藥復(fù)方是中醫(yī)治療疾病時(shí)整體觀的具體體現(xiàn)，是在辨證審因決定治法之后，選擇合適的藥物，酌定用量，按照“君、臣、佐、使”，“七情相合”的關(guān)系配伍而成；其作用機(jī)制是通過(guò)復(fù)方中各效應(yīng)成分對(duì)機(jī)體的多個(gè)環(huán)節(jié)予與調(diào)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到整體治療疾病的目的。中藥復(fù)方的核心問(wèn)題是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制和配伍規(guī)律，這既受到學(xué)術(shù)界公認(rèn)，亦是中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。 為此，我們提出中藥復(fù)方作用的“多靶點(diǎn)效應(yīng)整合”假說(shuō)：中藥復(fù)方通過(guò)相關(guān)效應(yīng)成分直接或間

2、接對(duì)機(jī)體分子起調(diào)節(jié)作用，多種效應(yīng)成分起多方面的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用在不同水平層次上形成相互制約的多級(jí)網(wǎng)絡(luò)式的整合，即所謂多靶點(diǎn)效應(yīng)整合，這種整合作用廣泛存在于核內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞與組織間、組織與組織間、致病與抗病間，以效應(yīng)成分對(duì)機(jī)體分子的調(diào)節(jié)為中心，按“分子—細(xì)胞—整體”逐級(jí)整合，最終在整體顯示治療作用，是中藥維持人體正常生理功能和控制疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。這是復(fù)方作用的基本規(guī)律之一，亦是中藥復(fù)方藥物與單體藥物作用的本質(zhì)區(qū)別。 大

3、量研究表明，心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)，而膽固醇在As的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為高膽固醇血癥與飲食不節(jié)(外源性)和內(nèi)傷肝、脾、腎等臟腑功能(內(nèi)源性)有關(guān)，最終導(dǎo)致膏脂生成、輸化失常。臨床廣泛應(yīng)用的中成藥降脂寧正是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，根據(jù)補(bǔ)益肝腎、消食祛痰、活血化瘀、降瀉濕濁的治則，由首烏、山楂、荷葉、決明子組方。本課題進(jìn)一步研究降脂寧顆?？箘?dòng)脈硬化以及調(diào)節(jié)膽固

4、醇代謝的多靶點(diǎn)效應(yīng)機(jī)制。 本課題創(chuàng)新點(diǎn)：為明確降脂寧調(diào)節(jié)膽固醇代謝以及抗動(dòng)脈粥樣硬化的多靶點(diǎn)藥理機(jī)制，探索出一套適合于中藥復(fù)方作用機(jī)制研究的新思路和方法，本項(xiàng)目建立在前人研究及我們前期工作的基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞生物學(xué)—分子生物學(xué)—藥理學(xué)相結(jié)合的方法，擬分別以ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，高脂飲食小鼠為高膽固醇血癥動(dòng)物模型，以肝細(xì)胞為體外模型，從而觀察降脂寧對(duì)膽固醇吸收、合成與轉(zhuǎn)化等主要代謝環(huán)節(jié)的影響，

5、最終觀察該藥對(duì)動(dòng)脈硬化斑塊形成的影響，以闡明該藥的多靶點(diǎn)效應(yīng)機(jī)理。試圖探索出一套適合于中藥復(fù)方作用機(jī)制相關(guān)性研究的新思路和方法。 1.降脂寧對(duì)高脂飲食小鼠血清及肝臟脂質(zhì)代謝的影響本研究結(jié)果顯示，經(jīng)飼喂高脂飲食4周后，模型組小鼠血清TC顯著升高(P＜0.001)，肝組織中TC、TG亦顯著升高(P＜0.001)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采用的高脂血癥小鼠模型是成功的。此外，與模型組比較，降脂寧大劑量組可以降低高脂血癥小鼠血清TC水平(P＜0.0

6、1)；同時(shí)，降脂寧兩個(gè)劑量組均可降低肝組織中TC(P＜0.05，0.01)、TG含量(P＜0.05，0.001)。結(jié)果表明，降脂寧具有較好的降脂作用?？梢宰鳛樘接懼兴帍?fù)方作用的“多靶點(diǎn)效應(yīng)整合”假說(shuō)的工具藥物。 2.降脂寧對(duì)高脂飲食小鼠膽汁生成的影響肝臟中膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化是機(jī)體膽固醇清除的最重要途徑。因此增加膽汁的生成，加速膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，可有效地對(duì)膽固醇代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。 結(jié)果表明，降脂寧兩個(gè)劑量均可以促進(jìn)高脂血

7、癥小鼠膽汁的排泄，增加其膽汁流量，與模型組比較有顯著性差異(p＜0.05)。此外，降脂寧兩個(gè)劑量均可以促進(jìn)高脂血癥小鼠膽汁單位時(shí)間內(nèi)TBA的合成量，與模型組比較有顯著性差異(p＜0.05，0.01)。表明降脂寧可以促進(jìn)膽汁酸的生成。以上結(jié)果表明，降脂寧可以促進(jìn)體內(nèi)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化。 3.降脂寧含藥血清對(duì)肝細(xì)胞膽固醇代謝環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)機(jī)制機(jī)體內(nèi)膽固醇代謝環(huán)節(jié)主要涉及膽固醇的吸收、合成、轉(zhuǎn)化三個(gè)相關(guān)環(huán)節(jié)，其中吸收主要與LDL-R相關(guān)

8、；合成的關(guān)鍵限速酶為HMG-COA還原酶；轉(zhuǎn)化為膽汁酸的主要限速酶為CYP7A1。肝臟在調(diào)節(jié)膽固醇水平中發(fā)揮主要作用，它表達(dá)機(jī)體大部分的LDLR，而且是將膽固醇降解為膽汁酸的主要場(chǎng)所。故而，本研究以肝細(xì)胞為研究重點(diǎn)，探討不同時(shí)間點(diǎn)降脂寧含藥血清對(duì)于肝細(xì)胞BEL-7402膽固醇代謝各環(huán)節(jié)相應(yīng)靶點(diǎn)的影響，明確其作用機(jī)理。 研究結(jié)果表明，30min-180min時(shí)間點(diǎn)降脂寧含藥血清均可顯著升高BEL-7402細(xì)胞表面LDL-R表達(dá)量；

9、各時(shí)間點(diǎn)含藥血清均不能夠提高BEL-7402細(xì)胞表面LDL-R結(jié)合LDL的能力；30min時(shí)間點(diǎn)降脂寧含藥血清可顯著提高BEL-7402細(xì)胞表面LDL-R的內(nèi)化能力(p＜0.001)，其他時(shí)間點(diǎn)降脂寧含藥血清無(wú)此作用。不同時(shí)間點(diǎn)降脂寧含藥血清可顯著升高BEL-7402細(xì)胞LDL-RmRNA表達(dá)水平(120min除外)。此外，10％降脂寧含藥血清60min和150min時(shí)間點(diǎn)均可顯著降低BEL-7402細(xì)胞中HMG-CoA還原酶mRNA表

10、達(dá)量；30min-150min時(shí)間點(diǎn)均可顯著升高BEL-7402細(xì)胞中CYP7A1mRNA表達(dá)量，而180min時(shí)間點(diǎn)反而會(huì)降低CYP7A1mRNA表達(dá)量，具有顯著的抑制作用。降脂寧含藥血清對(duì)于肝細(xì)胞的膽固醇吸收、合成、轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)均具有不同程度的促進(jìn)以及抑制作用，這也從從分子層面證明，降脂寧正是通過(guò)膽固醇代謝各環(huán)節(jié)的多靶點(diǎn)效應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)發(fā)揮其藥理效應(yīng)。而不同時(shí)間點(diǎn)則具有不同的作用效果，這可能與不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清中效應(yīng)成分的差異以及相應(yīng)各環(huán)

11、節(jié)的反饋性調(diào)節(jié)有關(guān)。 4.降脂寧抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的效應(yīng)機(jī)制研究高膽固醇血癥是As病變形成的決定因素，而氧化型LDL(ox-LDL)更具致病性。血管內(nèi)皮在血管穩(wěn)態(tài)中所起到的軸心作用，對(duì)于內(nèi)皮依賴的血管舒張及維持內(nèi)皮功能完整性過(guò)程中，NO起關(guān)鍵作用。減少的NO生物利用度可導(dǎo)致“內(nèi)皮功能紊亂”，產(chǎn)生包括穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化狹窄損傷或者是急性粥樣斑塊破裂所引起的不穩(wěn)定型心絞痛和心肌梗塞。故在預(yù)防及治療As中，不僅要加強(qiáng)血脂的調(diào)節(jié)，而且應(yīng)

12、重視提升機(jī)體的抗氧化能力及保護(hù)血管內(nèi)皮功能。 本研究采用ApoE-/-小鼠做為動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察降脂寧對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響以及其可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明降脂寧大、小劑量組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊形成較輕，有相當(dāng)一部分未見(jiàn)斑塊形成，可顯著降低粥樣斑塊面積與管腔面積之比(PA/LA)，與模型組比較有顯著性差異(均為p＜0.001)。此外，降脂寧大劑量可顯著降低血清中TC、TG水平(均P＜0.01)；降脂寧小劑量、降脂寧

13、大劑量均可顯著升高ApoE-/-小鼠血清NO水平，與模型組比較有顯著性差異(p＜0.05，0.01)；降脂寧大劑量可顯著降低ApoE-/-小鼠血清MDA含量，與模型組比較有顯著性差異(p＜0.01)；而且降脂寧小劑量組和大劑量組均可升高ApoE-/-小鼠血清脂聯(lián)素水平(與模型組比較，均p＜0.001)。以上結(jié)果表明降脂寧具有較好的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，此作用的產(chǎn)生可能與其降血脂、提高機(jī)體抗氧化能力、調(diào)節(jié)脂聯(lián)素等多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)有關(guān)。

14、 綜上所述，降脂寧可降低血清、肝臟組織中膽固醇含量，增加膽汁及膽汁酸的生成；其含藥血清可以促進(jìn)LDLRmRNA表達(dá)、細(xì)胞表面LDLR表達(dá)量及其內(nèi)化能力；含藥血清可以促進(jìn)CYP7A1mRNA表達(dá)以及抑制HMG-CoAmRNA表達(dá)。表明降脂寧可從“分子-細(xì)胞-組織”水平，以及膽固醇的“吸收-合成-轉(zhuǎn)化”環(huán)節(jié)對(duì)膽固醇代謝進(jìn)行多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的效應(yīng)整合調(diào)節(jié)。此外，降脂寧亦可通過(guò)降低ApoE-/-小鼠血清TC、TG水平，降低MDA含量，升高NO、脂