高膽固醇血癥致動(dòng)脈粥樣硬化的若干機(jī)制研究.pdf

1、高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)重要的危險(xiǎn)因素之一,可通過誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、損害血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝和功能等諸多作用,最終導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展.但迄今為止,高膽固醇血癥誘導(dǎo)產(chǎn)生AS的具體機(jī)制仍未明了.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成分泌的糖蛋白,是體內(nèi)促血管生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的主要細(xì)胞因子.研究顯示,在高膽固醇血癥患者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中,其VEGF水平可明顯升高[1-3];但并非所有的研究

2、都能得到相同的結(jié)果[4,5].有研究表明,VEGF的上調(diào)有助于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂時(shí)血管壁內(nèi)外物質(zhì)交換的動(dòng)態(tài)平衡[6],但也有研究提示,VEGF過表達(dá)可增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,促進(jìn)脂蛋白及炎癥細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜下,誘導(dǎo)和促進(jìn)AS早期病變的發(fā)生和發(fā)展,因此,VEGF也可能參與了AS的形成[7-10].還有學(xué)者提出,VEGF介導(dǎo)的血管生成是導(dǎo)致AS斑塊發(fā)展的必要充分條件[11].但高膽固醇血癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF合成和分泌的直接影響還不清

3、楚.高膽固醇血癥時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體Ⅰ的密度和親和力增加[12].而研究表明,血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)具有獨(dú)立于抗高血壓,抗高血脂的抗AS的作用[13].Strawn等的研究顯示,在飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥動(dòng)物模型中,給予Losartan治療,還可減少動(dòng)脈壁脂質(zhì)條紋中源之巨噬細(xì)胞的泡沫細(xì)胞[14].但ARB的抗AS作用機(jī)制目前尚不明確.緊密連接是血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu),呈帶狀圍繞在細(xì)胞邊緣,

4、在各細(xì)胞間連接成網(wǎng)狀,是調(diào)控細(xì)胞間大分子通透性的主要結(jié)構(gòu).動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉著是AS形成初期的一個(gè)必經(jīng)過程,其機(jī)制仍不清楚.在既往的.AS危險(xiǎn)因素與血管壁脂質(zhì)沉著研究中,研究重點(diǎn)集中在高膽固醇血癥對(duì)血管通透性的影響上,對(duì)機(jī)制的研究不多,同時(shí)也缺乏有關(guān)AS危險(xiǎn)因素與內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接之間關(guān)系的分子生物學(xué)方面的研究.基于上述研究現(xiàn)狀, 目的: 1.觀察高膽固醇血癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF合成和分泌的直接影響,探討ARB的抗As作用

5、機(jī)制. 2.觀察高膽固醇血癥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白復(fù)合體的影響,探討AS形成時(shí)動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積的機(jī)制. 方法: 1.建立永生化血管內(nèi)皮細(xì)胞系原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購自上海Digestech公司,接種到Matrigel基質(zhì)中,分別用含端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染原代血管內(nèi)皮細(xì)胞,用新霉素衍生物及嘌呤霉素進(jìn)行篩選,培養(yǎng)建立篩選的細(xì)胞系.分別通過wester

6、n blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染的hTERT和SV40LT,光鏡、掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察,免疫組織化學(xué),ELISA和RT-PCR對(duì)建立的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定. 2.觀察內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的變化用含1﹪膽固醇的飼料喂養(yǎng)家兔,獲得高膽固醇血清.在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中分別加入不同稀釋度的高膽固醇血清,不同濃度的替米沙坦及磷脂酰肌醇.3激酶(P13K)特異性抑制劑wortmannin,通過ELISA和western blot分別測(cè)定其

7、VEGF的表達(dá),測(cè)定P13K活性[15].最后,采用體外血管生成試驗(yàn)進(jìn)一步佐證其VEGF表達(dá)的改變. 3.觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO.1的表達(dá)和分布的改變對(duì)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片、固定,采用免疫熒光技術(shù),觀察ZO-1的分布;通過western blot和RT-PCR檢測(cè)ZO-1的表達(dá).通過血管滲透試驗(yàn),觀測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化.P13K活性測(cè)定及P13K特異性抑制劑wortmannin也被用于上述實(shí)驗(yàn).

8、 結(jié)論: 1.通過SV40LT和hTERT的共同異位表達(dá),可有效實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生命周期的顯著延長(zhǎng). 2.高膽固醇血清可通過PI3K信息通路增加血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá). 3.替米沙坦對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)無影響. 4.替米沙坦可促進(jìn)高膽固醇血清所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的高表達(dá). 5.高膽固醇血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)無明顯作用;但可改變ZO-1在內(nèi)皮細(xì)胞中的分布,增加