高磷血癥致膽固醇敏感器SCAP功能失調(diào)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分高磷血癥通過(guò)誘導(dǎo)SCAP功能失調(diào)促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化
　　目的：
　　高磷血癥是慢性腎臟病患者動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，其促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制不清楚。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）裂解激活蛋白（SCAP）是細(xì)胞內(nèi)的膽固醇敏感器，在反饋性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡中具關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究表明：病理狀態(tài)下SCAP功能失調(diào)可致多種外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常聚集。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立ApoE-/-

2、小鼠高磷血癥模型，探討高磷狀態(tài)下膽固醇敏感器SCAP功能狀態(tài)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為：正常飲食組（Chow組，含磷0.6%，n=8）、高磷飲食組（hP組，含磷1.6%，n=8）組、高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組（hPS組，n=12）以及高磷血癥司維拉姆治療組（hPST組，n=8）。高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組給予含有3%碳酸司維拉姆的高磷飲食，高磷血癥司維拉姆治療組則先給予高

3、磷飲食喂養(yǎng)8周成功建立高磷血癥，再繼續(xù)給予含有3%碳酸司維拉姆的高磷飲食。SPF級(jí)喂養(yǎng)共16周時(shí)處死小鼠，檢測(cè)血鈣、磷、尿素氮、血脂等生化指標(biāo)，制備主動(dòng)脈連續(xù)冰凍切片并行油紅O染色評(píng)價(jià)粥樣硬化斑塊負(fù)荷，行免疫組化染色以及Western blot檢測(cè)SCAP、SREBP2、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCoAR）和低密度脂蛋白受體（LDLr）水平。
　　結(jié)果：
　　高磷飲食喂養(yǎng)8周時(shí)，ApoE-/-小鼠血磷水平顯著高于普

4、通飲食組，表明小鼠已出現(xiàn)高磷血癥。喂養(yǎng)16周時(shí)，高磷飲食組小鼠血磷仍顯著高于普通飲食組（P＜0.05），高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組小鼠血磷較高磷飲食組明顯降低（P＜0.05），但高磷血癥司維拉姆治療組血磷仍顯著高于普通飲食組，且與高磷飲食組比較無(wú)差別。血尿素氮、血脂等指標(biāo)在四組小鼠間無(wú)顯著差異。主動(dòng)脈根部連續(xù)冰凍切片油紅O染色及斑塊定量分析顯示：高磷飲食組小鼠粥樣斑塊負(fù)荷（以斑塊面積/血管截面積表示）顯著大于正常飲食組和高磷飲食聯(lián)合司維拉姆

5、組（P＜0.05），但與高磷血癥司維拉姆治療組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組織化學(xué)染色與Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：高磷飲食組與高磷血癥司維拉姆治療組小鼠N-SREBP2、HMGCoAR、LDLr及SCAP蛋白水平明顯高于普通飲食組及高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組。
　　結(jié)論：
　　高磷血癥通過(guò)上調(diào)血管組織細(xì)胞內(nèi)SCAP蛋白水平，使其異常運(yùn)載SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體并經(jīng)酶解釋放其氨基端片段N-SREBP2，后者轉(zhuǎn)位入核并與

6、其靶基因啟動(dòng)子上游的SRE結(jié)合，上調(diào)LDLr與HMGCoAR等靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血漿中LDL經(jīng)LDLr攝入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成，最終促進(jìn)Apo E-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。口服磷結(jié)合劑碳酸司維拉姆可有效預(yù)防高磷飲食引起的高磷血癥并減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變，但在已形成持續(xù)高磷血癥的小鼠，碳酸司維拉姆干預(yù)效果不理想，這可能與持續(xù)高磷血癥激活PTH、FGF-23等代償機(jī)制有關(guān)。
　　第二部分高磷環(huán)境下膽固醇敏感器S

7、CAP功能失調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積
　　目的：
　　觀察高磷環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚的影響與分子機(jī)制。
　　方法：
　　將PMA誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞分為對(duì)照組（磷1.0 mmol/L）、高磷處理組（磷3.0 mmol/L）、磷甲酸鈉（PFA）處理組（PFA1.0 mmol/L）以及高磷聯(lián)合PFA處理組，無(wú)血清培養(yǎng)基中處理24小時(shí)后，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)分布，酶法定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，Re

8、al time-PCR法測(cè)細(xì)胞內(nèi)羥甲基戊二酸單酰輔酶 A還原酶（HMGCoAR）、低密度脂蛋白受體（LDLr）、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）mRNA表達(dá)，Western blot法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SCAP、LDLr、HMGCoAR及核內(nèi)固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白2（N-SREBP2）蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組相比，高磷處理組巨噬細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)明顯聚集，高磷處理可顯著增加細(xì)胞內(nèi)總膽固醇與膽固醇酯的含量（P＜0.0

9、5），這種作用可被細(xì)胞表面鈉磷轉(zhuǎn)運(yùn)體pit-1的特異性阻斷劑PFA所阻斷（高磷聯(lián)合PFA處理組）（P＜0.05）。高磷處理組巨噬細(xì)胞LDLr、HMGCoAR mRNA與蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)N-SREBP2水平也明顯增高，加入PFA（高磷聯(lián)合PFA處理組）可抑制上述效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：高磷處理組巨噬細(xì)胞內(nèi)控制SREBP2轉(zhuǎn)位激活的關(guān)鍵伴侶分子 SCAP蛋白水平明顯增高（P＜0.05），但其mRNA表