他汀類藥物治療動脈粥樣硬化的免疫機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　心腦血管疾病是目前全球范圍內(nèi)致死率和致殘率都非常高的疾病，其本質(zhì)上的病理變化是相關(guān)血管的動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。研究認(rèn)為AS是一種免疫性疾病，感染、免疫缺陷及自身免疫都參與了AS的病理、生理過程。固有免疫和適應(yīng)性免疫的多種免疫細(xì)胞和免疫因子參與了AS的發(fā)生和發(fā)展，自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)被發(fā)現(xiàn)存在于AS斑塊中，參與了AS的形成。研究表明，AS中NK細(xì)

2、胞數(shù)量下降，細(xì)胞毒性功能減弱。NK細(xì)胞可分為功能不同的兩個亞群:CD3-CD56bright NK細(xì)胞和CD3-CD56dim NK細(xì)胞。NKT細(xì)胞是兼有NK細(xì)胞和T細(xì)胞特征的一群細(xì)胞，表面同時表達(dá)NK細(xì)胞和T細(xì)胞上存在的部分分子結(jié)構(gòu)。NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞活化后均可分泌干擾素-γ（IFN-γ），動物實驗顯示IFN-γ有促進(jìn)AS形成的作用。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin-and mucin-domai

3、n-containing molecule-3，Tim-3)是一型跨膜蛋白Tim家族的一員，被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等多種細(xì)胞表面。在慢性乙型肝炎患者中，NKT細(xì)胞上Tim-3表達(dá)上調(diào);在多種疾病狀態(tài)下，NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)均升高，同時伴有NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性及IFN-γ分泌減少。在動脈粥樣硬化患者外周血中，NK細(xì)胞上Tim-3分子也被發(fā)現(xiàn)表達(dá)升高。
　　他汀類藥物是一種3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG

4、-CoA)還原酶抑制劑，臨床上廣泛用于AS的治療，對AS及相關(guān)疾病有良好的治療效果。研究提示，他汀類藥物發(fā)揮抗AS的作用并不完全依賴于其降血脂的功效，他汀類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用在其中有著重要影響。他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶而影響下游多種成分的生成，進(jìn)而影響下游小分子參與的生物過程，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
　　然而，他汀類藥物通過免疫調(diào)節(jié)作用治療AS的機(jī)制尚不完全清楚，本研究旨在通過研究他汀類藥物對AS外周血NK細(xì)胞和NKT細(xì)

5、胞表面Tim-3分子和IFN-γ分子的影響，初步探索他汀類藥物治療AS可能通過的免疫途徑，為臨床治療提供更多的實驗和理論基礎(chǔ)。
　　研究對象和方法:
　　1.研究對象:
　　研究對象為2016年1月-12月期間于山東省千佛山醫(yī)院就診的35歲-79歲的患者，經(jīng)影像學(xué)或者超聲檢查診斷患有AS。嚴(yán)格按照入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選患者。本研究由山東大學(xué)千佛山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。每一位入組的患者均被告知了本研究，并同意了相關(guān)事宜。<

6、br>　　有14例服用瑞舒伐他汀治療的患者（其中2位患者每天10 mg，其余患者每天20 mg，口服，連續(xù)服用3個月以上）和12例服用阿托伐他汀治療的患者（其中1位患者每天5 mg，其余患者每天10 mg，口服，連續(xù)服用3個月以上）被納入實驗，以及20例未服用他汀類藥物治療的患者被納入實驗作為對照。抽取每位被納入實驗的患者的空腹外周靜脈血。
　　2.實驗方法:
　　將收集的外周血盡快使用淋巴細(xì)胞分離液處理，提取外周單個核細(xì)胞

7、(PBMCs)，制備細(xì)胞懸液。取PBMCs細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記的抗人CD3、PerCP標(biāo)記的抗人CD56及APC標(biāo)記的抗人Tim-3的抗體，于4℃避光環(huán)境下孵育30分鐘后上機(jī)檢測NK細(xì)胞（CD3-CD56+細(xì)胞），CD3-CD56brightNK細(xì)胞，CD3-CD56dim NK細(xì)胞，CD3-CD56+Tim-3+細(xì)胞，CD3-CD56brightTim-3+細(xì)胞，CD3-CD56dimTim-3+細(xì)胞，NKT細(xì)胞（CD3+CD5

8、6+細(xì)胞），CD3+CD56+Tim-3+細(xì)胞，CD3+Tim-3+細(xì)胞以及Tim-3分子在NK細(xì)胞及其亞群上的平均熒光素強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。另取PBMCs細(xì)胞懸液在含刺激阻斷劑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時之后，加入FITC標(biāo)記的抗人CD3、PerCP標(biāo)記的抗人CD56抗體于4℃避光環(huán)境下孵育30分鐘后，固定、破膜，加入PE標(biāo)記的抗人IFN-γ抗體，于4℃避光環(huán)境下孵育30分鐘后重懸上機(jī)，

9、流式檢測CD3-CD56+IFN-γ+細(xì)胞、CD3+CD56+IFN-γ+細(xì)胞和CD3+IFN-γ+細(xì)胞。
　　3.統(tǒng)計學(xué)處理:
　　采用SPSS20統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料中，符合正態(tài)分布及方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），其余數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis one-way ANOVA)比較三組樣本的組間差異。分類變量資料采用x2檢驗(chi-square test)進(jìn)行分析

10、。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.共有46例患者被納入研究，在瑞舒伐他汀治療組、阿托伐他汀治療組和對照組中，男性患者所占比例無明顯差異(78％，67％，75％，p=0.78)，年齡無統(tǒng)計學(xué)差異（63.3±2.4，67.1±2.3，64.0±1.9,p=0.48），糖尿病患者所占比例無統(tǒng)計學(xué)差異(21％,33％,20％, p=0.67)。
　　2.他汀類藥物治療降低了NK細(xì)胞及其細(xì)胞亞群中Tim-3

11、+細(xì)胞所占的比例以及三群細(xì)胞上Tim-3的MFI（瑞舒伐他汀治療組vs對照組和阿托伐他汀治療組vs對照組的p值依次為:Tim-3+ NK細(xì)胞p=0.003,p=0.003; NK細(xì)胞上Tim-3的MFI p=0.019, p=0.011;CD3-CD56brightTim-3+ NK細(xì)胞p=0.002, p=0.001;CD3-CD56bright NK細(xì)胞中Tim-3的MFI,p=0.004，p=0.004; CD3-CD56dimT

12、im-3+ NK細(xì)胞p=0.004，p=0.005; CD3-CD56dim NK細(xì)胞中Tim-3的MFI，p=0.021，p=0.013）。
　　3.他汀類藥物治療降低了NKT細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞中Tim-3+細(xì)胞的比例（瑞舒伐他汀治療組vs對照組:p＜0.001，p＜0.001;阿托伐他汀治療組vs對照組:p＜0.001，p=0.009);增加了外周血單個核細(xì)胞中NKT細(xì)胞的比例（瑞舒伐他汀治療組vs對照組:p=0.092;阿