刃天青顯色法和Dxr酶抑制劑模型對海洋真菌來源抗弧菌活性物質(zhì)的高通量篩選.pdf

1、弧菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最重要的細(xì)菌病之一，其爆發(fā)后死亡率高，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。人們?yōu)榱朔乐嗡a(chǎn)動物弧菌病，大量盲目使用抗生素，使耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，使病害更加難以控制，需要不斷地尋找新的、安全的抗菌藥物。海洋真菌因其獨特生長代謝機制，具有產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性強的化合物的潛力，成為當(dāng)下國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。
　　本研究以篩選抗弧菌的活性化合物為目標(biāo)，建立刃天青熒光高通量微量顯色法，優(yōu)化刃天青顯色法實驗條件，并對比平板稀

2、釋法，評價了刃天青方法在測定藥物對弧菌最低抑菌濃度(MIC)實驗中的適用可行性，并實現(xiàn)了對來源于32株海洋真菌的916個初級餾分的活性篩選，具有直觀、可靠、靈敏、微量、經(jīng)濟等優(yōu)點。根據(jù)篩選結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報道挑出尖刀鐮孢菌、白色側(cè)齒霉、黃曲霉三株真菌進行重新發(fā)酵，利用正相反相柱層析、TLC、HPLC方法分離出次級餾分，用刃天青顯色方法進行活性跟蹤，從白色側(cè)齒霉發(fā)酵物中分離出對供試弧菌均有抑菌活性的新化合物EngyodontiuminA。<

3、br>　　萜類化合物及其衍生物是自然界分布最廣泛、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的一類次生化合物。生物體內(nèi)的萜類化合物主要有兩種生物合成途徑:甲羥戊酸途徑(mevalonatepathway，MVA)和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathwayMEP)。研究表明，MEP途徑廣泛存在于大多數(shù)致病菌、藻類、地衣及高等植物等，但目前尚未在人體和動物中發(fā)現(xiàn)該途徑，因此該途徑的關(guān)鍵酶已成為潛

4、在抗菌素、抗瘧藥物和除草劑的靶點。1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)是該途徑中第一個限速酶，本實驗克隆和表達(dá)創(chuàng)傷弧菌DXR蛋白并優(yōu)化其酶活測定方法，在此基礎(chǔ)上建立弧菌DXR抑制劑高通量篩選模型，并對利用刃天青篩選出的有抗菌活性的20個次級餾分進行DXR酶活性研究，獲得2個陽性餾分，在進一步的深入研究中有望于從這些餾分中找到DXR酶的有效抑制劑，同時揭示其抗微生物的可能分子機制。兩種方法為新型抗菌藥物或先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)提供了依