腸道病毒71型3C蛋白酶抑制劑高通量篩選體系的構(gòu)建.pdf

1、手足口病(Hand-Foot-Mouth Diease，HFMD)是威脅人類健康的頑疾之一，每年有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的嬰幼兒感染病例，并造成上千例的死亡。近幾年，手足口病一直位居我國(guó)丙類傳染病首位。引起人類手足口病的主要病原體中，人類腸道病毒71型(EV71)有著比其他病原體更強(qiáng)的致病性，并且更加常見。針對(duì)EV71病毒感染的治療藥物和手段的研究迫在眉睫。
　　EV71病毒的3C蛋白酶對(duì)于病毒自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖，以及誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋

2、亡有著舉足輕重的作用。因此，以EV71病毒的3C蛋白酶為靶點(diǎn)的抑制劑已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)展開了廣泛而深入的研究。
　　本論文首先運(yùn)用本課題組自主設(shè)計(jì)合成的熒光多肽底物對(duì)EV71病毒的3C蛋白酶進(jìn)行了有效的活性評(píng)價(jià)，并甄選出了活性最佳的底物Pep-2。依照酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，運(yùn)用雙倒數(shù)曲線法求取了其米氏常數(shù)Km=127.6μM，最大反應(yīng)速率Vmax=3.2μM·min-1，催化常數(shù)kcat=0.65 min-1。并運(yùn)用3C蛋白酶的最優(yōu)底物

3、Pep-2，探討了酶促反應(yīng)的各項(xiàng)影響因素，確定了最適pH=7.0，最適反應(yīng)溫度T=37℃，緩沖液最適NaCl濃度為150 mM。
　　在活性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，建立了3C蛋白酶抑制劑的高通量活性篩選體系，對(duì)本課題組自主設(shè)計(jì)合成的小分子競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，以及計(jì)算機(jī)虛擬篩選出來(lái)的高結(jié)合能小分子進(jìn)行了活性篩選，得到了184種抑制劑的半數(shù)抑制濃度IC50。這為后續(xù)的EV71病毒3C蛋白酶抑制劑的開發(fā)提供了大量的數(shù)據(jù)支撐，通過(guò)定量構(gòu)效分析，可以為3C