腸道71型病毒3C和3D蛋白的表達(dá)、純化、結(jié)晶及藥物篩選.pdf

1、腸道71型病毒，是小核糖體病毒中的一種，能在人和動物中引起手足口病，在個別嚴(yán)重病例中，能夠破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而引起病毒性腦膜炎，腦炎，以及重癥心肌炎，以及致命的肺水腫。由于兒童的免疫系統(tǒng)相對脆弱，所以特別容易收到此類病毒的感染。1998年，在臺灣爆發(fā)了一場由EV71病毒引發(fā)的感染病，總共有120，000名兒童被感染并造成了78人死亡，在2008年5月，中國衛(wèi)生局報道了一場在中國安徽由EV71病毒引發(fā)的大規(guī)模感染病，截止到5月7日，總共

2、造成28人死亡。
　　目前，世界上還沒有能夠治療此類病毒的有效藥物，腸道71型病毒的3C蛋白酶是病毒大的多聚蛋白前提水解成單個成熟蛋白所必須的，它是由病毒基因組翻譯而來的，所以被認(rèn)為是治療小核糖體病毒感染的重要靶點蛋白。在本實驗中，我們在基于EV713C蛋白酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過晶體與化合物分子共晶和高通量分子藥物篩選的方法尋找能夠抑制此病毒蛋白酶的有效抑制劑。具體方法就是通過基因工程手段將EV713C蛋白酶的基因?qū)氪竽c桿菌BL21

3、(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，使其獲得大量表達(dá)，并通過鎳柱層析，陽離子交換層析等手段獲得高純度蛋白，以進(jìn)一步用于蛋白結(jié)晶和藥物篩選。AG7088被認(rèn)為是能夠有效抑制冠狀病毒蛋白酶的有效藥物，它是一種多肽類藥物，我們在基于此化合物的基礎(chǔ)上合成了一系列衍生物和結(jié)構(gòu)類似藥物，并篩選出了能夠有效抑制EV71病毒的有效抑制劑。
　　EV71病毒RNA依賴的RNA聚合酶3D是病毒基因組編碼的重要的酶，它催化了病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。由于在宿主細(xì)胞中沒

4、有類似的RNA依賴的RNA聚合酶，所以這類聚合酶就也成為了抗EV71病毒藥物開發(fā)的首選靶標(biāo)。在本實驗中，我們將EV713D蛋白酶的基因?qū)氪竽c桿菌(BL21)感受態(tài)細(xì)胞，通過GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）親和層析柱和陰離子交換柱純化蛋白獲得高純度蛋白，為后續(xù)的蛋白質(zhì)結(jié)晶做好鋪墊。同時我們建立了針對3C蛋白酶和3D聚合酶抑制劑的細(xì)胞-病毒篩選體系，為更好的篩選3D聚合酶的抑制劑做好了鋪墊。此外，我們還得了3D聚合酶與基因組編碼的22個氨基酸的V