2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、心肌肥大是心肌細胞對多種病理刺激產(chǎn)生的一種適應性反應,是引起多種心血管疾病的重要危險因素之一。心肌肥大相關(guān)疾病如高血壓、心衰等普遍存在且嚴重威脅人類健康?,F(xiàn)有藥物治療心肌肥大的效果并不理想,因此尋找能夠干預心肌肥大的新的藥物靶點對于開發(fā)治療心肌肥大的藥物具有重要意義。 本論文探討了ECE-1家族對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)誘導的心肌細胞肥大的調(diào)控作用,以及ECE-1各亞型在此調(diào)控過程中的主次地位;體外表達

2、在肥大過程中起主要作用的亞型ECE-1c,構(gòu)建以該亞型為靶點的體外藥物篩選體系并進行了短肽抑制劑的合成和體外篩選;評價了短肽抑制劑對心肌肥大的保護作用,為研究開發(fā)以ECE-1c亞型為靶點的治療心肌肥大及相關(guān)疾病的藥物提供理論依據(jù)及可進行高通量篩選的體外篩選體系。 第一章 ECE-1及其亞型在調(diào)控AngⅡ誘導的心肌細胞肥大過程中的作用 目的: ET-1已經(jīng)被證明是參與心肌肥大過程的重要因子,作為其產(chǎn)生過程中的限速

3、酶,ECE-1的表達量和活性直接影響ET-1的生成量。而ECE-1與心肌肥大的直接關(guān)系卻未見報道。因此我們觀察了ECE-1在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大過程中的變化,并采用小分子RNA干擾序列(small interference RNA,siRNA)沉默心肌細胞中ECE-1表達的方法探討了ECE-1在心肌肥大調(diào)控中的作用。同時,我們也觀察了ECE-1四個亞型在正常心肌細胞中的mRNA豐度以及四個亞型在心肌細胞肥大過程中的mRNA水平變化

4、,探討了ECE-1四個亞型在心肌肥大調(diào)控中的主次地位。 方法: 1、體外培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞,α—橫紋肌肌動蛋白(α—sarcomeric actin)免疫組化染色法鑒定心肌細胞的純度。 2、以0.1μM AngⅡ分別刺激心肌細胞12,24和36h,RT—PCR測定肥大因子心房利鈉肽(Atrial natriuretic factor,ANF),β—肌球蛋白重鏈(β—myosin heavy chain,β—MH

5、C)的mRNA變化,倒置顯微鏡觀察心肌細胞表面積的變化。 3、以0.1μM AngⅡ分別刺激心肌細胞12,24和36h,western—blot方法檢測ECE-1的蛋白表達變化。 4、Fluorescent Oligo與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000以不同比例轉(zhuǎn)染心肌細胞后48h,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。使用siRNA干擾序列RSS331827轉(zhuǎn)染心肌細胞,RT—PCR和western—blot方法測定ECE-

6、1的表達被沉默的程度。 5、siRNA negative control low GC和RSS331827分別轉(zhuǎn)染心肌細胞后48h,加入0.1μM AngⅡ刺激心肌細胞24h,RT—PCR方法測定ANF,β—MHC的mRNA變化,倒置顯微鏡觀察心肌細胞表面積的變化。 6、RT—PCR和Realtime—PCR方法分別測定了四個亞型在正常心肌細胞中的mRNA豐度。 7、以0.1μM AngⅡ分別刺激心肌細胞12,2

7、4和36h,RT—PCR和Realtime—PCR方法分別檢測各個亞型的mRNA水平變化。 結(jié)論: 1、原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞的形態(tài)特征符合心肌細胞的形態(tài)特征,心肌細胞純度高于95%,可以用于實驗。 2、AngⅡ刺激心肌細胞24h可以誘導心肌細胞產(chǎn)生明顯肥大反應。 3、ECE-1在AngⅡ誘導的心肌肥大過程中表達顯著增加;下調(diào)ECE-1的表達可以顯著抑制AngⅡ誘導的心肌肥大反應,證明ECE-1與AngⅡ

8、誘導的心肌細胞肥大過程有密切關(guān)系。 4、心肌細胞中四種亞型均有表達,其中表達量最高的亞型為c亞型,其次為b,d亞型,a亞型最少。AngⅡ誘導的心肌肥大反應過程中,a和c亞型的mRNA水平呈時間依賴性顯著上調(diào),而b和d亞型mRNA水平無顯著變化。綜合考慮四個亞型在心肌細胞中的mRNA水平和肥大過程中的變化,我們認為相比于a,b和d亞型,c亞型與心肌肥大的關(guān)系更為密切。 第二章以ECE-1c為靶點的體外藥物篩選體系構(gòu)建

9、 目的: 從第一章的結(jié)果中,我們知道ECE-1在調(diào)控心肌肥大過程中起重要作用,以及這種調(diào)控作用主要是由ECE-1c亞型來實現(xiàn)的。為了篩選具有ECE-1c抑制活性的化合物,我們利用經(jīng)典的分子克隆方法在體外表達了大鼠ECE-1c蛋白并獲得了穩(wěn)定表達ECE-1c的CHO單克隆細胞系,并利用表達的ECE-1c與其天然底物大鼠big ET-1建立了測定ECE-1c酶活性的反應體系,摸索確定了最佳的反應條件。該活性評價體系可以用來在體外快

10、速多樣本地篩選對ECE-1c具有抑制作用的化合物。 方法: 1、提取SD大鼠頸總動脈mRNA,用RT—PCR方法得到ECE-1c的讀碼框DNA片段。將該片段克隆至載體質(zhì)粒pCDNA3.1中構(gòu)建重組質(zhì)粒,并測序鑒定。 2、將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細胞,使用有限稀釋法在G418壓力下篩選穩(wěn)定表達單細胞克隆,挑取多個克隆使用western—blot測定各個克隆中ECE-1c的表達量,表達量最高的克隆被保存下來持續(xù)培養(yǎng)傳

11、代3個月,RT—PCR和western—blot測定ECE-1c的穩(wěn)定表達情況。 3、以表達的大鼠ECE-1c和其天然底物大鼠big ET-1以及相應的緩沖體系建立了ECE-1c酶反應體系,ELISA法測定反應生成的ET-1的量來反映酶活性。測定了表達的大鼠ECE-1c的酶動力學常數(shù)。 結(jié)論: 1、構(gòu)建了ECE-1c—pCDNA3.1重組質(zhì)粒。 2、在CHO細胞中穩(wěn)定表達了大鼠ECE-1c蛋白,表達的蛋白

12、具有正常的酶活性。 3、篩選得到的ECE-1c穩(wěn)定表達單細胞克隆使我們可以持續(xù)低成本的獲得表達的大鼠ECE-1c蛋白,以此為基礎(chǔ)建立的酶反應體系能夠快速地多樣本地進行化合物的篩選。 第三章 ECE-1c抑制性短肽的合成、篩選及其對心肌肥大的保護作用 目的: 為了得到具有ECE-1c抑制活性的短肽,并初步評價得到的短肽是否能夠抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。我們以大鼠bigET-1為模板設(shè)計合成了

13、13條短肽。利用構(gòu)建的體外篩選系統(tǒng)對短肽的ECE-1c抑制作用進行了篩選,挑選出了抑制效果最好的2條短肽,進一步使用AngⅡ誘導的心肌細胞肥大模型對短肽的心肌肥大的保護作用進行了評價。 方法: 1、短肽采用固相合成技術(shù)進行合成,使用制備型HPLC進行純化。 2、將合成純化的短肽加入ECE-1c酶反應測定體系,對短肽體外抑制ECE-1c活性的能力進行評價。 3、MTT法評價了P8和P9對心肌細胞活力的影響。

14、 4、使用篩選到的短肽孵育心肌細胞1h,再與AngⅡ(0.1μM)共同處理心肌細胞24h。RT—PCR方法測定肥大因子β—MHC的mRNA變化,倒置顯微鏡觀察心肌細胞表面積的變化。 結(jié)論: 1、Pl—P13在體外表現(xiàn)出不同程度的ECE-1c活性抑制作用。在13條短肽中,P8和P9具有較強的ECE-1c活性抑制作用。 2、P8和P9濃度至100μM對心肌細胞活力無明顯影響。P8和P9可以顯著抑制AngⅡ誘導

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