腫瘤抑制基因CADM1在肝癌中的表達(dá)調(diào)控及其功能研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi)腫瘤致死原因排第3位,導(dǎo)致每年約60萬人死亡。我國(guó)是個(gè)乙肝大國(guó),乙肝病毒攜帶率在國(guó)民中很高。作為肝炎-肝硬化-肝癌這一發(fā)展鏈的終末端,肝癌在我國(guó)的高發(fā)成為無可爭(zhēng)辯的事實(shí),從而使我國(guó)成為全世界肝癌的最高發(fā)地區(qū)之一。與肝癌發(fā)生相關(guān)的主要危險(xiǎn)因素有酗酒、黃曲霉素?cái)z入、HBV感染和HCV感染等。隨著人類基因組學(xué)的長(zhǎng)足發(fā)展和對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)的不斷深入,

2、人們意識(shí)到腫瘤發(fā)生發(fā)展是個(gè)極其復(fù)雜的過程,眾多基因的變化和表觀遺傳學(xué)等的改變涉及其中。綜合目前對(duì)肝癌的研究進(jìn)展,我們尚不能對(duì)其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制做出科學(xué)合理的解釋。所以對(duì)肝癌形成發(fā)展機(jī)制的深入挖掘,鑒定并發(fā)展肝癌治療的新靶標(biāo)具有重要的意義。
　　 隨著外科技術(shù)的發(fā)展,肝移植已經(jīng)被人們接受成為治愈肝癌的最好治療方案之一,但是部分病人肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的現(xiàn)實(shí)依舊成為制約受者長(zhǎng)期存活的瓶頸因素。應(yīng)用理想生物指標(biāo)將患者進(jìn)行分類,可幫助臨床

3、醫(yī)生鑒定出術(shù)后易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)病例,并提供個(gè)性化的干預(yù)治療,以改善病人的預(yù)后。圍繞腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移這一熱點(diǎn)問題,大量預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)記鑒定研究已經(jīng)開展,到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)能夠廣泛應(yīng)用于臨床的可靠的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　 表觀遺傳學(xué)的改變是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要事件。作為表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容,DNA甲基化導(dǎo)致腫瘤抑制基因的失活被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的早期機(jī)制之一。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞黏附、

4、細(xì)胞凋亡、DAN修復(fù)和腫瘤血管生成等的過程中發(fā)揮重要的作用。近年來大量的研究報(bào)道了DNA甲基化在腫瘤患者預(yù)后中的預(yù)測(cè)作用,其作為一類生物標(biāo)記已顯示出良好的應(yīng)用前景。細(xì)胞黏附分子1(Cell adhesion molecule l,CADM1)是最近通過功能互補(bǔ)試驗(yàn)而在人類非小細(xì)胞肺癌中鑒定為腫瘤抑制基因。大量的證據(jù)表明CADM1參與了人類眾多腫瘤的形成與發(fā)展。在本課題中,我們首次檢測(cè)了CADM1在肝癌中的表達(dá),探討影響其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,

5、嘗試揭示其腫瘤抑制的可能機(jī)制,最后評(píng)估其在肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值。
　　 第一部分腫瘤抑制基因CADM1的表達(dá)調(diào)控及啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化對(duì)肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的價(jià)值研究。
　　 目的:
　　 肝移植是肝癌患者最佳治療選擇之一,但大約20％-40％的患者在移植5年內(nèi)會(huì)經(jīng)歷肝癌的復(fù)發(fā)。目前尚無可靠的生物學(xué)標(biāo)記可以做出分類,篩選出高危易復(fù)發(fā)病例。本實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)CADM1在肝癌細(xì)胞株和臨床標(biāo)本中的表達(dá),嘗試闡

6、述影響其表達(dá)的分子機(jī)制；同時(shí)檢測(cè)肝癌細(xì)胞株和臨床標(biāo)本中CADM1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài),并評(píng)估其在肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值。
　　 方法:
　　 應(yīng)用RT-PCR和免疫組化(immunollistochemistry,IHC)方法檢測(cè)CADM1在肝癌細(xì)胞株和臨床標(biāo)本中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。RT-PCR檢測(cè)甲基化酶抑制劑(5’-Aza-dC)用藥前后肝癌細(xì)胞株中CADM1的mRNA表達(dá)水平；并應(yīng)用基因掃描檢測(cè)肝癌

7、臨床標(biāo)本中的雜合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)情況,探討影響其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。采用重亞硫酸氫鹽修飾測(cè)序PCR(Bisulfite sequencingPolymerase Chain Reaction,BSP)的方法首先檢測(cè)10株肝癌細(xì)胞株和2株永生化正常肝細(xì)胞株中CADM1基因甲基化狀況,之后通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)確定CADM1基因的核心啟動(dòng)子區(qū),針對(duì)該區(qū)域采用結(jié)合重亞硫酸氫鹽的限制性內(nèi)

8、切酶法(COBRA)檢測(cè)了82對(duì)臨床肝癌組織中CADM1的甲基化狀態(tài)。最后收集肝癌肝移植病人臨床病理資料及隨訪資料,比較不同CADM1甲基化表型與病人臨床病理指標(biāo)及移植術(shù)后復(fù)發(fā)生存之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 CADM1異常甲基化在肝癌細(xì)胞株中發(fā)生的比例為50％(5／10),同時(shí)常伴有mRNA表達(dá)水平下降。應(yīng)用甲基化酶抑制劑5’-Aza-dC作用肝癌細(xì)胞株后,CADM1的表達(dá)得到恢復(fù)或明顯增強(qiáng)。LOH在肝癌組織中的發(fā)

9、生比例為13.8％(4／29)。CADM1的核心啟動(dòng)子序列位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前-146 bp至-226 bp,位于該區(qū)域中的Sp1結(jié)合元件在CADM1基因的轉(zhuǎn)錄過程中可能發(fā)揮重要的作用。針對(duì)該區(qū)域的甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CADM1甲基化在臨床肝癌標(biāo)本中的發(fā)生率為41.5％(34／82)。CADM1異常甲基化病例移植后腫瘤復(fù)發(fā)的發(fā)生概率明顯高于非甲基化病例(70.6％versus33.3％；P=0.001)。多因素分析提示CADM1甲基化是肝癌肝

10、移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.788；95％CI,1.043-5.063；P=0.010)。
　　 結(jié)論:
　　 在肝癌中,啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化是導(dǎo)致CADM1表達(dá)下調(diào)的主要調(diào)控機(jī)制。CADM1啟動(dòng)子區(qū)甲基化是影響移植后肝癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,對(duì)移植后腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)具有潛在的重要價(jià)值。
　　 第二部分腫瘤抑制基因CADM1在肝細(xì)胞肝癌中的抑癌作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 目的:
　　

11、 隨著對(duì)CADM1基因研究的深入開展,越來越多的證據(jù)顯示它和多數(shù)的人類腫瘤形成相關(guān)。在本課題中我們應(yīng)用了一系列的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證CADM1在肝癌形成發(fā)展中的作用,并分別采用體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)方法嘗試闡述CADM1在肝癌中作為腫瘤抑制基因的潛在機(jī)制。
　　 方法:
　　 為了評(píng)估CADM1在肝癌形成發(fā)展中的作用,我們首先成功構(gòu)建了該基因的真核表達(dá)載體,之后采用了一系列的細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)方法,包括CCK-8增殖抑制實(shí)驗(yàn)、Ed

12、U摻入增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)。最后應(yīng)用Western blot和siRNA等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)CADM1的腫瘤抑制作用的潛在機(jī)制作出探討。
　　 結(jié)果:
　　 應(yīng)用克隆技術(shù),我們成功構(gòu)建了CADM1的真核表達(dá)載體。在低表達(dá)CADM1的肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC-97L中,異位表達(dá)的CADM1顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖,并使細(xì)胞增殖停滯于G0／G1期。同時(shí),異位表達(dá)的CADM1明顯抑制了腫瘤細(xì)

13、胞體外形成克隆的能力；在體內(nèi),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CADM1表達(dá)載體的MHCC-97L細(xì)胞種植的裸鼠皮下腫瘤形成數(shù)目明顯低于空載體組(4／8 versus8／8)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Rb蛋白的表達(dá)豐度隨著CADM1的表達(dá)量的上調(diào)而增加,同時(shí)在臨床肝癌標(biāo)本中CADM1蛋白的表達(dá)與Rb蛋白的表達(dá)顯示出較為明顯的一致性。在高表達(dá)CADM1蛋白的BEL-7402細(xì)胞中,我們應(yīng)用siRNA敲除技術(shù)后發(fā)現(xiàn),CADM1蛋白沉默同時(shí)也伴有Rb蛋