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文檔簡介
1、目的：明確Pokemon在肝癌細(xì)胞中對CDK-1基因表達(dá)及其相關(guān)調(diào)控的分子機理。
方法：細(xì)胞是人肝癌HepG-2細(xì)胞和QGY-7703細(xì)胞。將Pokemon和CDK-1的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG-2和QGY-7703肝癌細(xì)胞中，分別收集cDNA和蛋白通過Real-time PCR和Western-blot觀察Pokemon調(diào)控CDK-1基因表達(dá)情況。構(gòu)建三段ATG上游1000bp不同長度的CDK-1啟動子熒光素酶報告基因載體，分
2、別轉(zhuǎn)染這三種報告基因載體到HepG-2和QGY-7703肝癌細(xì)胞中，通過雙熒光素酶報告基因檢測法確定CDK-1啟動子核心活性區(qū)域。利用雙熒光素酶報告基因檢測法及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試驗技術(shù)證實Pokemon能否直接結(jié)合CDK-1啟動子且調(diào)控其活性。
結(jié)果：在HepG-2和QGY-7703肝癌細(xì)胞中，通過Realtime-PCR發(fā)現(xiàn)Pokemon對CDK-1基因調(diào)控在mRNA水平有明顯的抑制作用。在HepG-2和QGY-
3、7703肝癌細(xì)胞中隨著Pokemon siRNA轉(zhuǎn)染時間的延長，CDK-1的蛋白表達(dá)量逐步增加。應(yīng)用PCR的方法成功的克隆三段不同長度的CDK-1基因啟動子序列，分別對應(yīng)ATG上游1018bp、541bp、242bp，再分別插入報告基因質(zhì)粒載體PGL4.10中，構(gòu)建得到不同長度的CDK-1啟動子報告基因質(zhì)粒載體。在 HepG-2和QGY-7703肝癌細(xì)胞系中，通過雙熒光素酶報告基因檢測Pokemon對CDK-1啟動子活性的下調(diào)均在pLu
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