天然反義轉(zhuǎn)錄本TSPAN31調(diào)控CDK4基因表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響.pdf

1、目的：
　　四跨膜蛋白超家族（transmembrane4 super family，TM4SF）是一類小分子糖蛋白，具有四個(gè)高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，目前在人類中已發(fā)現(xiàn)33個(gè)不同的TM4SF成員。四跨膜蛋白家族成員之間或與細(xì)胞膜表面分子相互作用，形成跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞粘附、侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TSPAN31是四跨膜蛋白超家族重要成員之一。文獻(xiàn)報(bào)道，TSPAN31可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而，對(duì) TS

2、PAN31功能及分子機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題我們著重研究TSPAN31在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中扮演的角色，進(jìn)一步探討它們?cè)诟伟┌l(fā)生發(fā)展中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其意義。
　　方法：
　　通過(guò)天然反義轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)（NATsDB）查詢 TSPAN31與 CDK4基因；利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)天然反義轉(zhuǎn)錄本TSPAN31與靶基因CDK4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)；在肝癌細(xì)胞中，利用干擾或過(guò)表達(dá)TSPAN31的方法檢測(cè)CDK4表達(dá)變化

3、，利用補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)探討TSPAN31對(duì)CDK4發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機(jī)制；通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性；利用侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè) siRNA沉默 TSPAN31對(duì)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響；通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析下調(diào) TSPAN31后細(xì)胞中β-catenin蛋白的分布情況；利用siRNA沉默TSPAN31或p53和藥物干預(yù)的方法探討TSPAN31在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果：
　　天然反義轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)（NATsD

4、B）顯示TSPAN31與CDK4屬于一對(duì)順式天然反義轉(zhuǎn)錄本。在肝癌細(xì)胞中，siRNA沉默TSPAN31上調(diào)CDK4 mRNA和蛋白水平，且TSPAN31主要通過(guò)3’UTR區(qū)調(diào)節(jié)CDK4表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示miR-135b靶向調(diào)控TSPAN31。PI3K小分子抑制劑LY-294002抑制miR-135b表達(dá)，上調(diào)TSPAN31 mRNA表達(dá)水平。
　　siRNA沉默 TSPAN31有效抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。TSPA

5、N31調(diào)控MT1-MMP介導(dǎo)的MMP2活性。我們?cè)谟^察siRNA沉默TSPAN31對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路上相關(guān)基因表達(dá)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，TSPAN31表達(dá)下調(diào)抑制 pAKT、pGSK3β和β-catenin蛋白表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示 TSPAN31下調(diào)后細(xì)胞核內(nèi)分布的β-catenin蛋白減少。在肝癌細(xì)胞中，siRNA沉默p53促進(jìn)TSPAN31表達(dá)，MDM2小分子拮抗劑 Nutlin-3下調(diào) TSPAN31 mRNA和蛋白水平，這提