XAGE基因的表達及其在腫瘤生長與轉移中的功能研究.pdf

1、癌癥是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，探索診斷和治療癌癥的手段是生物學研究的重要任務。轉移性和侵襲性是惡性腫瘤的重要特征，與基因和蛋白質水平上的一系列改變密切相關。本實驗室前期對涎腺腺樣囊性癌(Adenoidcystic carcinoma of salilary gland，SACC)高、低轉移細胞系ACC-M和ACC-2的mRNA表達譜比較研究時發(fā)現(xiàn)，腫瘤睪丸抗原(Cancer/testis antigen，CTAs)家族成員XAG

2、E-1在ACC-M細胞中有較高表達現(xiàn)象。用RNA干擾降低ACC-M細胞中XAGE-1的表達使得該細胞在體外和體內的轉移率下降。該結果提示XAGE-1可能是一種和ACC腫瘤轉移密切相關的CTAs。
　　 已有報道XAGE-1在尤文肉瘤、黑色素瘤、肺腺癌等腫瘤中有較高表達；其表達受到甲基化調控；在肺癌和前列腺癌患者體內能刺激體液和細胞免疫應答；但功能未知。本論文對XAGE-1在口腔腫瘤中的表達及不同剪接體差異表達機制，在腫瘤細胞生長

3、和轉移中的作用、機理和可能的免疫學應用進行了研究。
　　 整個研究分為5個部分。第一部分利用Real-time PCR和免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)方法檢測了XAGE-1在口腔腫瘤及部分正常組織中的表達，結果顯示XAGE-1四種剪接體在口腔腫瘤中的表達有較大差異，其中1b表達量最高，和1d表達相關聯(lián)；1a和1c表達量較低；在ACC腫瘤中有較高水平的表達；在淋巴結中天然表達。
　　 第二部分

4、我們對XAGE-1上游啟動子區(qū)域采用熒光素酶報告載體，進行了轉錄活性分析。結果顯示，1b轉錄本上游片段的轉錄活性遠高于1a上游片段，兩個轉錄本間隔181bp的一段序列可能是造成1a，1b轉錄活性巨大差異的主要原因；并且1b在腫瘤細胞SPC-A1中的轉錄活性要高于正常胚胎細胞293T；在ACC-M中的轉錄活性要高于ACC-2細胞。對XAGE-1四種剪接體進行亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)1a，1b，1c都是核內定位，1d為全細胞分布，提示存在XAGE

5、-1特異的核定位信號。
　　 第三部分中，我們構建了真核表達XAGE-1b的載體，對該基因影響腫瘤細胞生長和轉移進行了研究。發(fā)現(xiàn)XAGE-1b過表達可以促進細胞的生長和克隆形成，而XAGE-1b穩(wěn)定表達細胞株裸鼠皮下移植瘤的生長速度也較對照加快，出現(xiàn)肺轉移。穩(wěn)定干擾XAGE-1b的ACC-M細胞株在體外和裸鼠皮下生長速度減慢，穿膜能力下降。
　　 第四部分我們檢測了瞬時表達XAGE-1b對ACC-2細胞周期、凋亡的影響。

6、發(fā)現(xiàn)XAGE-1b表達使得ACC-2細胞周期G0-G1期減少，G2-M增加；也使得ACC-2細胞對1250u/ml的TNF-α或者血清饑餓誘導凋亡有一定的耐受作用。用Mercury信號通路質粒系統(tǒng)分析，結果顯示XAGE-1b表達對RB，CRE，C-Myc，HSE，E2F，GRE，NF-κB因子的反應元件有不同程度的轉錄激活，對P53，AP1稍有抑制。其中，對RB(P<0.01)和C-Myc(P<0.05)的激活作用顯著。進一步對C-My

7、c和RB作濃度梯度實驗，結果顯示XAGE-1b對C-Myc反應元件的激活呈較好的線性關系，表達質粒300ng時激活作用達到對照組的7倍；而對RB的激活作用較弱，達到飽和濃度時為對照組的2倍。
　　 為了進一步弄清ACC-2細胞的免疫遺傳學特征，第五部分研究中，我們對ACC-2細胞株進行了HLA(Human Leukocyte Antigen)分型，確定其HLA型別為HLA-A24/68，B72/72，DR1/1。同時建立了一種基

8、于融解曲線分析的快速HLA-DR位點熒光分型方法，為后續(xù)XAGE-1的免疫學研究打下基礎。
　　 綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)XAGE-1基因在包括ACC腫瘤在內的口腔腫瘤中有表達，在淋巴結中天然表達；XAGE-1b為優(yōu)勢轉錄本，核定位；證明XAGE-1b具有促進ACC腫瘤細胞生長和轉移作用；并從機理上提示XAGE-1b可能對細胞周期、細胞凋亡等重要信號通路發(fā)揮轉錄調控功能。以上結果為XAGE-1相關腫瘤診斷和治療研究奠定了良好基礎，也