TIP30在肺癌組織中的表達及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的體外研究.pdf

1、肺癌是當今世界上發(fā)病率增長最快和死亡率最高的惡性腫瘤。然而由于肺癌發(fā)病隱匿、惡性程度高、發(fā)展迅速,80％的肺癌患者就診時已處于進展期。目前,僅有20％-30％的患者得到早期診斷。盡管采用手術(shù)、放療和化療等綜合治療措施,由于腫瘤轉(zhuǎn)移和多藥耐藥,總的5年生存率仍低于15％。因此,深入研究肺癌的轉(zhuǎn)移機制,尋找更加有效的診斷和治療方法是肺癌研究中迫切需要解決的重要課題。大量研究表明,肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過

2、程,這期間基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活及其導(dǎo)致一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常等分子病理學(xué)改變貫穿了肺癌病變的全過程。篩選出高靈敏性,高特異性的腫瘤標記物,從分子水平輔助肺癌的早期診斷,監(jiān)測肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后,進行靶向性腫瘤生物治療,具有重要的臨床應(yīng)用價值。 TiP30,又稱CC3,是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因,最早是通過RNA差異顯示技術(shù)比較高轉(zhuǎn)移性小細胞肺癌(v-SCLC)和低轉(zhuǎn)移性小細胞肺癌(c-SCLC)mRNA時發(fā)現(xiàn)的。近

3、年來的研究表明,TIP30在多種正常組織中表達,在黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、惡性膠質(zhì)細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝細胞癌等多種腫瘤中表達下調(diào)。早期的研究發(fā)現(xiàn)TIP30具有抑制腫瘤細胞增殖,抑制腫瘤血管生成,促進腫瘤細胞凋亡等作用。TIP30基因的突變體具有了癌基因的功能,并且TIP30敲除老鼠可自發(fā)生成多種腫瘤,并導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管細胞的癌前轉(zhuǎn)化。 早期的研究表明,TIP30缺失的小細胞肺癌細胞株比表達TIP30的細胞對死亡信號(無生長因子

4、、放化療藥物等)的耐受能力更強,并且將TIP30基因轉(zhuǎn)入高轉(zhuǎn)移性小細胞肺癌細胞株(TIP30表達缺失)明顯地抑制了細胞的增殖能力,增加了細胞對死亡刺激信號的敏感性,并抑制腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,證明TIP30在小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 但是,TIP30在肺癌組織中的表達及其與臨床指標的相關(guān)性尚未見報道。成功制備了高純度高特異性TIP30多克隆抗體,利用組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測206例肺癌及癌旁組織和部分

5、轉(zhuǎn)移灶中TIP30的表達,分析TIP30表達與多項臨床指標的相關(guān)性及其與患者預(yù)后的關(guān)系,并對其生物學(xué)功能在肺癌細胞株中進行了進一步驗證。 研究方法及結(jié)果： 1.重組人TIP30基因克隆、蛋白表達、純化及多克隆抗體的制備：成功克隆人TIP30基因,用含GST標簽的pGEX-4T-2載體,構(gòu)建重組pGEX-TIP30表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。用異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達,并以Gluta

6、thione-Sepharose 4B純化GST-TIP30融合蛋白,免疫新西蘭白兔,制備高滴度高特異性抗TIP30多克隆抗體。 2.組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化檢測TIP30在肺癌組織中的表達及其與臨床指標的關(guān)系：利用Envision法檢測TIP30在206例肺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達情況,按照免疫組化評分,將TIP30在肺癌組織中的表達分為高表達組和低表達組。TIP30蛋白呈棕黃色顆粒分布于細胞漿,未見胞核著色。正常肺癌組織均有

7、著色,主要分布于支氣管上皮和肺泡上皮。在非小細胞肺癌中TIP30低表達組占36.5％(72/197)；在9例小細胞肺癌中,TIP30均為低表達。在鱗狀細胞癌,腺癌,腺鱗癌中的低表達率分別為36.7％(33/90),36.2％(34/94)和38.5％(5/13),組織類型間TIP30表達無顯著性差異。比較70例病人原發(fā)灶和相應(yīng)的淋巴轉(zhuǎn)移灶中TIP30表達變化,TIP30在轉(zhuǎn)移灶中表達水平明顯下降。在肺鱗癌中,高分化及I-II期癌組織中T

8、IP30的表達高,低分化及Ⅲ-IV期肺癌組織中其表達降低。在鱗癌和腺癌中TIP30和p53表達呈負相關(guān)。對其中2001-2002年74例患者隨訪,TIP30和病人預(yù)后呈正相關(guān)。 3.TIP30對NSCLC細胞增殖和轉(zhuǎn)移潛能的調(diào)節(jié)作用：運用實時定量PCR和Western blotting蛋白印跡檢測五種肺癌細胞(A549,NCI-H460,SK-MES-1,LTEP-a-2,H1299)內(nèi)源性TIP30基因的表達情況,選取TIP3

9、0高表達細胞株A549和TIP30低表達細胞株H1299。利用慢病毒載體干擾A549內(nèi)源TIP30表達或?qū)IP30導(dǎo)入H1299腫瘤細胞,和對照組相比,下調(diào)內(nèi)源性TIP30表達后A549細胞的增殖能力,軟瓊脂克隆形成能力,對無血清刺激耐受能力及遷移和侵襲能力顯著增強；而轉(zhuǎn)染TIP30后,H1299細胞的增殖減慢,軟瓊脂克隆形成數(shù)目少,細胞遷移和侵襲能力顯著下降。 結(jié)論： 1.成功制備高純度高特異性抗人TIP30多克隆抗

10、體,為進一步研究TIP30功能奠定基礎(chǔ)； 2.約36％的非小細胞肺癌組織中TIP30表達水平下降,TIP30和p53表達呈負相關(guān),TIP30表達水平和鱗癌的臨床分期和分化相關(guān),表明。TIP30表達失調(diào)參與非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展； 3.TIP30的表達水平和患者的存活時間密切相關(guān),檢測TIP30表達可能成為一項重要的預(yù)后判斷指標； 4.TIP30的表達強度從正常組織,原發(fā)性癌組織和轉(zhuǎn)移灶中依次下降,體外實驗證明T