TIP30基因mRNA在肝癌細胞中的表達及其5’-UTR區(qū)CpG島甲基化的實驗研究.pdf

1、實驗背景與實驗目的: 肝細胞癌是我國最常見也是死亡率最高的惡性腫瘤之一,每年因患肝癌而死亡的人數(shù)約占全世界肝癌死亡人數(shù)的50﹪;其惡性程度高、進展快,且容易發(fā)生術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是限制其療效的關鍵因素.肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個由多基因控制,受多因素影響,多階段多步驟的復雜過程;在這個過程中癌基因的激活或抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展最基本的分子基礎.尋找腫瘤惡變過程發(fā)生異常改變的基因,研究其表達調(diào)控機制,闡明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作

2、用,將有利于我們認識腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制,提高腫瘤的臨床治療率. riP30,是一種30kD的Tat(Transactivator of transcription)結合蛋白(Tat-Interaefive Promin),又稱HTATIP2(Hβ-1 Tat interactive protein 2),是Xiao H等在研究人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HⅣ)的體外轉(zhuǎn)錄時發(fā)現(xiàn)的,其作為

3、HⅣ轉(zhuǎn)錄的輔助因子可以和Tat相互結合特異性地提高HⅣ增殖.TIP30在人類的多種組織如心、腦、肺、腎、骨骼肌和胰腺中均有表達,但在多種腫瘤組織中表達下降或缺失.研究表明:一方面,TIP30/CC3是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子,具有絲/蘇氨酸激酶活性可以和RNA聚合酶Ⅱ最大亞基結合并磷酸化其C-末端的七肽重復基序,在特定生理病理環(huán)境下調(diào)節(jié)細胞凋亡和血管生成相關基因的表達從而促進細胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移;另一方面TIP30/CC3能夠以RanGTP非

4、依賴形式直接與Importin β家族成員及核孔蛋白相結合抑制核轉(zhuǎn)運蛋白的功能,通過抑制核物質(zhì)輸入促進細胞凋亡來發(fā)揮抑癌作用. DNA甲基化是一種基因表觀性修飾,它不改變基因序列但會影響染色質(zhì)結構或修飾DNA空間結構從而影響基因表達.DNA甲基化狀態(tài)的改變是細胞癌變的關鍵因素,是腫瘤抑制基因失活的方式之一,它通過基因機制和基因外機制導致細胞增殖和分化的相關基因表達異常,造成細胞失去正常過程的控制而發(fā)生惡變形成腫瘤.近年來,DNA

5、甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到人們的關注,研究腫瘤相關基因的異常甲基化有助于深入理解腫瘤形成機理,并且可以為腫瘤的早期診斷、病理分型、療效評估及復發(fā)檢測等提供十分重要的信息. TIP30基因是否存在甲基化改變以及甲基化是否影響了它在腫瘤細胞中的表達,目前國內(nèi)外尚無相關報道.本課題通過檢測肝癌細胞中TIP30基因mRNA的表達,揭示該基因與肝癌的關系,并通過MSP和BSP方法檢測基因5'-UTR區(qū)的CpG島甲基化狀態(tài),探索該

6、基因在肝癌細胞中下調(diào)的原因以及該基因啟動子甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用.實驗方法: 1.應用real-time PCR檢測11P30基因mRNA在肝癌細胞中的表達情況,比較肝癌細胞系和正常肝細胞系TIP30基因mRNA的表達差異. 2.采用熒光素酶報告基因載體PGL-3 Enhancer分析TIP30啟動子在HL7702細胞系中的活性: 3.利用PLOTCpG程序?qū)IP30基因5'-UTR區(qū)的CpG島進行了分析

7、,并利用Methyl Primer Express Software 1.0設計MSP和BSP引物,建立了檢測TIP30基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的方法. 4.用MSP和BSP法檢測了不同肝癌細胞株TIP30基因5'-UTR區(qū)的甲基化狀態(tài). 5.用甲基化抑制劑處理肝癌細胞,觀察其對肝癌細胞TIP30表達的影響.實驗結果: 1.TIP30基因mRNA在正常肝細胞和肝癌細胞中都有表達,但不同細胞間的表達差異較大 2.TI

8、P30基因mRNA在多數(shù)肝癌細胞中的表達明顯低于正常肝細胞(p<0.01),但在PLC和XJC肝癌細胞中其表達量明顯高于正常肝細胞. 3.在HL7702細胞中,TIP30基因啟動子的-135/-45是TIP30的主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū),TESS軟件分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在SP1多個結合位點. 4.PLOTCpG程序分析發(fā)現(xiàn)TIP30基因5'-UTR區(qū)存在兩個典型的CpG島,一個跨越轉(zhuǎn)錄起始位點,一個跨越翻譯起始位點. 5.MS

9、P和BSP結果顯示在TIP30 mRNA表達低的肝癌細胞中部分細胞該基因5'-UTR區(qū)是甲基化的,部分TIP30表達低的和TIP30表達高的肝癌細胞及正常肝細胞都沒有甲基化現(xiàn)象,說明甲基化參與了TIP30基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,是TIP30基因在肝癌中表達降低的原因之一.6.甲基化抑制劑明顯提高了5'-UTR區(qū)甲基化的肝癌細胞TIP30 mRNA的表達.實驗結論:1.首次采用Real-Time PCR方法檢測了肝癌細胞和正常肝細胞中TIP30基

10、因mRNA的表達,發(fā)現(xiàn)不同細胞TIP30的表達存在較大差異,和正常肝細胞相比多數(shù)肝癌細胞TIP30mRNA的表達是降低的,揭示了TIP30和肝癌之間的相關性.2.首次對TIP30基因的啟動子功能進行了研究,并發(fā)現(xiàn)-135/-45是其主要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū),該區(qū)域存在多個可能的SPl結合位點.3.首次應用PLOTCpG程序?qū)IP30基因5'-UTR區(qū)進行CpG島分析,發(fā)現(xiàn)了兩個典型的CpG島,其中第一個島CpG二核苷酸含量更豐富,更容易被甲基