5’CpG島甲基化檢測(cè)基因芯片的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物DNA甲基化主要指CpG島的甲基化修飾，是一種重要的表觀遺傳模式，與基因激活、基因印記、細(xì)胞分化與發(fā)育、以及衰老和癌變等一系列生命過(guò)程密切相關(guān)，是當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。雖然CpG島甲基化的分析方法發(fā)展較為迅速，但因目前缺乏有效的高通量甲基化分析方法，以致嚴(yán)重阻礙了這些生命活動(dòng)調(diào)控規(guī)律的研究。基因芯片是近十幾年來(lái)發(fā)展極快的一項(xiàng)技術(shù)平臺(tái)，具有高通量、高靈敏度、快速自動(dòng)等顯著的特點(diǎn)，目前已應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突

2、變及多態(tài)性分析等多項(xiàng)分子研究領(lǐng)域，CpG島甲基化檢測(cè)芯片也有所發(fā)展，但速度緩慢。針對(duì)這一需要，本論文發(fā)展了三種類(lèi)型甲基化檢測(cè)芯片，為實(shí)現(xiàn)更高通量甲基化分析芯片的制備，還對(duì)CpG島數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建做了大膽探索。具體內(nèi)容如下： (1)IGFBP7基因甲基化譜寡核苷酸芯片分析技術(shù)研究IGFBP7是一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白編碼基因，這種蛋白能夠通過(guò)與IGF-2結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制有絲分裂活性，對(duì)于卵泡發(fā)育及胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育都具有重要的

3、調(diào)控作用，而且也是一種重要的腫瘤抑制基因。本研究的目的旨在開(kāi)發(fā)一種用于IGFBP7基因甲基化譜分析的寡核苷酸芯片。該方法的步驟為：提取正常人血液乖人類(lèi)乳腺癌組織樣本基因組DNA，進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，修飾過(guò)后的基因組DNA中甲基化的胞嘧啶保持不變，而未發(fā)生甲基化的胞嘧啶則轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，以修飾后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為測(cè)序引物，也就是將引物設(shè)計(jì)在不含有CpG二核苷酸的位點(diǎn)上，結(jié)果導(dǎo)致所擴(kuò)增區(qū)域未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，而

4、甲基化的位則不發(fā)生變化。其中以正常人血液基因組DNA為陰性對(duì)照樣本，而M.sssI處理的(這種酶的處理可以導(dǎo)致所有基因組中CpG二核苷酸中的胞嘧啶都發(fā)生甲基化)正常人血液基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于腫瘤樣本，由于各個(gè)片斷甲基化的狀態(tài)不同，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物就可能是各種甲基化狀態(tài)的一種混合物。本研究針對(duì)PCR產(chǎn)物中18個(gè)CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)了6對(duì)寡核苷酸探針，每對(duì)探針包含2-4個(gè)CpG二核苷酸位點(diǎn)，其中一條探針與甲基化的靶序列的相匹配，另一條探針

5、與未甲基化的靶序列相匹配。將探針固定在處理后的DAKO玻片上，然后與CY3標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物雜交，激光掃描儀掃描并分析雜交結(jié)果。采用陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物與陰性克隆PCR產(chǎn)物參比建立定量檢測(cè)曲線。參比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于每對(duì)探針，PCR產(chǎn)物甲基化水平與熒光信號(hào)強(qiáng)度比值M/(M+U)有良好的線性相關(guān)性。本研究共檢測(cè)了15對(duì)乳腺癌組織IGFBP7基因甲基化譜，發(fā)現(xiàn)所有樣本中的所有位點(diǎn)甲基化程度都在85％以上，這種雜交結(jié)果采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法得到進(jìn)一步

6、證明。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明此芯片技術(shù)可以作為一種有用的工具進(jìn)行IGFBP7基因多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化譜定量分析。 (2)基于微陣列與雙色熒光雜交的高通量分析甲基化檢測(cè)芯片研究目前所報(bào)導(dǎo)的用于甲基化檢測(cè)的芯片都是針對(duì)一個(gè)樣本的多個(gè)基因或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行高通量分析，包括前一個(gè)實(shí)驗(yàn)也是如此，這些方法都不能同時(shí)分析大量樣本以利于有效篩選生物標(biāo)記物。因此建立一種高通量分析大量樣本的基因芯片方法具有重要意義。在本研究中發(fā)展了一種新的方法，具體操作為

7、：首先提取人類(lèi)乳腺腫瘤樣本基因組DNA，并準(zhǔn)備陰性和陽(yáng)性樣本(方法同上)，將基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，以亞硫酸氫鹽處理的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物固定在多聚賴(lài)氨酸處理的玻片上，做成PCR產(chǎn)物芯片。設(shè)計(jì)一對(duì)包含三個(gè)相鄰的CpG位點(diǎn)探針，一條探針是針對(duì)發(fā)生甲基化的靶序列，采用CY5(紅色)標(biāo)記，另一條是針對(duì)未甲基化的靶序列，采用CY3(綠色)標(biāo)記，用雙色熒光標(biāo)記的探針與芯片雜交，雜交信號(hào)通過(guò)掃描儀不同濾光片掃描后分別獲取

8、CY5或CY3信號(hào)強(qiáng)度，信號(hào)采用GenepixPro3.0軟件處理，通過(guò)綠色信號(hào)強(qiáng)度與紅色信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比來(lái)確定樣本甲基化的含量。陰性和陽(yáng)性PCR產(chǎn)物參比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣本甲基化含量與CY5/(CY5+CY3)的比值呈良好的線性相關(guān)(R2=0.9871)，將該技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)20例乳腺癌組織、6例相對(duì)應(yīng)的正常乳腺組織和一株肝癌細(xì)胞系共27個(gè)樣本的IGFBP7基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)除血液組織樣本是陰性外，其他都呈陽(yáng)性，此結(jié)果與前一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一

9、致，并得到進(jìn)一步測(cè)序證明。此項(xiàng)研究結(jié)果表明該方法能夠用于大規(guī)模樣本甲基化定量分析，對(duì)于篩選甲基化分子標(biāo)記基因具有廣闊的應(yīng)用前景。 (3)基于尼龍膜雜交和地高辛標(biāo)記的一種高通量甲基化基因芯片研究前一個(gè)研究獲得的方法雖能夠高通量定量分析大量樣本甲基化狀態(tài)，具有廣闊的應(yīng)用前景，但其檢測(cè)靈敏度不高，為了提高檢測(cè)靈敏度和適用范圍，本研究又發(fā)展了亞硫酸氫鹽修飾靶序列DNA芯片方法。與第二種方法不同之處在于將雜交載體由玻片變?yōu)槟猃埬?，因?yàn)槟猃?/p>

10、膜固定DNA量較大而且固定效率較高；第二個(gè)不同之處，在于將探針標(biāo)記物由熒光標(biāo)記改為地高辛標(biāo)記。地高辛是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高靈敏度的檢測(cè)方法，可以取代同位標(biāo)記用于Southernblot和Northernblot檢測(cè)；第三個(gè)不同之處在于本研究還將本研究首先亞硫氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組DNA直接固定在尼龍膜上制作基因組DNA芯片。首先將樣本基因組DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物固定在尼龍膜上進(jìn)行甲基化分析。為了獲得該方法

11、的靈敏度，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物片段與陰性PCR產(chǎn)物片段按不同比例混合成甲基化含量不同的樣本固定制作成芯片，另外還將陽(yáng)性基因組DNA和陰性基因組DNA按不同比例混合成甲基化含量不同的樣本。同時(shí)還將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA在帶有陽(yáng)離子的尼龍膜上，制作亞硫酸氫鹽修飾靶序列DNA陣列。然后與標(biāo)有地高辛的探針雜交，采用化學(xué)發(fā)光的方法來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定的乳腺癌腫瘤樣本與正常人血液組織樣本檢測(cè)結(jié)果與前二種方法檢測(cè)的一致，并得到進(jìn)一步的克隆

12、測(cè)序證明。直接參比陰性和陽(yáng)性PCR產(chǎn)物可以發(fā)現(xiàn)該雜交體系每個(gè)點(diǎn)可以檢測(cè)到3.05×105拷貝數(shù)片段，而參比陰性和陽(yáng)性基因組DNA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以從40960個(gè)正常甲基化DNA中檢測(cè)到一個(gè)非正常DNA樣本；將1μg基因組DNA固定于尼龍膜上，選取合適的探針和雜交溫度，可以區(qū)分甲基化的等位基因，由此證明這兩種方法是可靠靈敏的，具有大規(guī)模檢測(cè)等位基因甲基化程度較低的樣本而且具有從大量樣本中高通量篩選甲基化分子標(biāo)記物的應(yīng)用潛力。 (4)基

13、于抑制性差減雜交技術(shù)構(gòu)建CpG島文庫(kù)的方法學(xué)研究構(gòu)建CpG島文庫(kù)是發(fā)展某些高通量DNA甲基化分析芯片的基礎(chǔ)與前提，目前構(gòu)建CpG島文庫(kù)的方法較為煩瑣而且篩選也較為困難，本研究將抑制性差減雜交技術(shù)和甲基化特殊檢測(cè)原理相結(jié)合，旨在發(fā)展一種簡(jiǎn)便的構(gòu)建CpG島文庫(kù)的方法。此方法將正常人血液基因組DNA酶切后的片段的接上接頭，然后作甲基化敏感酶HPAⅡ酶切，再進(jìn)行Linker-PCR，其產(chǎn)物作為Driver；M.SssⅠ酶處理的人類(lèi)基因組DNA酶

14、切后作為T(mén)ester，接上接頭之后Tester做一步HAaⅡ酶切。經(jīng)過(guò)兩次雜交后，然后將雜交產(chǎn)物進(jìn)行兩次抑制性PCR，并將PCR產(chǎn)物克隆入載體，挑取克隆分別進(jìn)行PCR和測(cè)序檢測(cè)差減雜交效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在挑取的288個(gè)克隆中，PCR擴(kuò)增有121個(gè)克隆插入的片段大于100bp，選取12個(gè)PCR擴(kuò)增出來(lái)的克隆進(jìn)行測(cè)序，共有7個(gè)克隆得到理想的測(cè)序結(jié)果，差減效率為58.3％，在這些測(cè)序片段中，有三條序列GC含量較高，而且CpG位點(diǎn)較多；其他四條序列