人類線粒體基因組CpG甲基化模式.pdf

1、目的:我們在最近的一項(xiàng)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(DNA甲基化在鑒別同卵雙生個(gè)體中的研究，No.30973364)的研究中，發(fā)現(xiàn)人類血液樣本線粒體DNA控制區(qū)的一段序列甲基化水平為2％～34％，并在同卵雙生子(monozygotic twins，MZT)之間存在較大差異，可以鑒別多達(dá)31.93％的MZT，且具有明顯的組織差異性，其在唾液樣本中得甲基化程度幾近于0。這些結(jié)果引發(fā)了我們對于mtDNA甲基化這一研究領(lǐng)域的關(guān)注和思考。追蹤有關(guān)mtDN

2、A甲基化研究的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該領(lǐng)域的研究較少，并且存在爭議。最早關(guān)于mtDNA甲基化的研究報(bào)道出現(xiàn)在30年前，Dawid對青蛙和Hela細(xì)胞的研究表明，二者均不存在mtDNA甲基化。之后有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠、倉鼠、人類等種屬，應(yīng)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶分析均檢測到低水平的mtDNA甲基化。近來有研究報(bào)道m(xù)tDNA甲基化與多種疾病相關(guān)，但也有報(bào)道認(rèn)為mtDNA幾乎沒有甲基化。這些存在矛盾的結(jié)果可能與mtDNA甲基化檢測的方法不同有關(guān)。亞硫酸氫鹽

3、轉(zhuǎn)化焦磷酸測序技術(shù)是目前公認(rèn)的檢測DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠?qū)γ恳粋€(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行精確定量，并通過內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化率而具有較高的準(zhǔn)確性。
　　綜上，本研究擬應(yīng)用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化焦磷酸測序技術(shù)對線粒體甲基化進(jìn)行進(jìn)一步研究，將檢測覆蓋mtDNA控制區(qū)、13個(gè)蛋白質(zhì)基因、2個(gè)rRNA基因及22個(gè)tRNA基因的CpG位點(diǎn)的甲基化情況，建立人類線粒體基因組DNA甲基化精確定量檢測方法，繪制一張較完整的人類線粒體基因組甲基化圖譜，為mt

4、DNA甲基化遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:按照知情同意原則，采集健康個(gè)體外周血樣本154例，收集漱口水樣本24例，每位受試者均簽署知情同意書。對線粒體基因組CpG位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)共有435個(gè)CpG位點(diǎn)且分布不均勻，其中輕鏈復(fù)制起始點(diǎn)(OL)(5721～5798bp)處分布密度最高，tRNA基因分布密度最低。根據(jù)上述生物信息學(xué)分析結(jié)果，應(yīng)用Assay Design引物設(shè)計(jì)軟件分區(qū)段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和

5、測序引物，本研究共設(shè)計(jì)20對擴(kuò)增引物及相應(yīng)的20條測序引物，可檢測20條序列共83個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化程度。20條序列依次命名為MT1～MT20。提取血液樣本及漱口水樣本的全基因組DNA，用BamHⅠ處理DNA將mtDNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。已轉(zhuǎn)化的DNA為模板，PCR擴(kuò)增20條特異性mtDNA序列，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，獲得各CpG位點(diǎn)的甲基化定量值。本實(shí)驗(yàn)通過MT1、MT2、MT3、MT4四條序列的分析比較開環(huán)組與

6、未開環(huán)組檢測情況的差異。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法有:配對t檢驗(yàn)、方差分析、秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化焦磷酸測序的影響
　　1.1.1線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對焦磷酸測序通過率的影響
　　通過對65～154個(gè)血液樣本的檢測，我們發(fā)現(xiàn)4條序列MT1、MT2、MT3、MT4在開環(huán)組的焦磷酸測序通過率分別為78.95％、97.32％、97.73

7、％、90.26％,而在未開環(huán)組的通過率分別為80.95％、84.62％、64.52％、47.89％。除MT1外，其余3條序列的通過率在開環(huán)組與未開環(huán)組之間均具有顯著性差異，且未開環(huán)組的通過率均明顯低于開環(huán)組。進(jìn)一步分析測序失敗的原因，發(fā)現(xiàn)在未開環(huán)組，除MT2外，其余3條序列內(nèi)質(zhì)控不通過所占比例均達(dá)80％以上，而在開環(huán)組，測序失敗的主要原因是峰信號過低。表明在血液樣本中不開環(huán)對亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化有顯著影響，轉(zhuǎn)化效率明顯低于開環(huán)組，導(dǎo)致焦磷酸

8、測序的通過率明顯降低。
　　1.1.2漱口水樣本
　　檢測的漱口水樣本數(shù)為14～24個(gè)。所檢測的4條序列MT1、MT2、MT3、MT4在開環(huán)組的焦磷酸測序通過率分別為87.50％、82.35％、94.12％、87.50％，而在未開環(huán)組的通過率分別為90.00％、87.50％、87.50％、94.44％，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。漱口水樣本未開環(huán)組DNA的測序通過率明顯高于血液樣本未開環(huán)組，而且與對應(yīng)的開環(huán)組無顯著差異，而且在測序

9、未通過的樣本中，并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化不完全導(dǎo)致的測序失敗，反而在開環(huán)組發(fā)現(xiàn)了兩例轉(zhuǎn)化不完全。該結(jié)果表明線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對漱口水樣本亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的影響較小。
　　1.2線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對甲基化定量數(shù)值的影響
　　1.2.1血液樣本
　　在血液樣本中，雖然未開環(huán)組的測序通過率較低，但仍在47％以上，那么這些測序成功的樣本甲基化程度與開環(huán)組相比是否存在差異呢？我們對二者進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)4條序列在未開環(huán)組的平均甲基化程

10、度分別為11.65％±0.29％，3.58％±0.27％，5.68％±0.20％，7.21％±0.27％，而在開環(huán)組的平均甲基化程度分別為1.16％±0.09％，1.68％±0.10％，0.32％±0.05％，0.78％±0.09％，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明二者存在顯著差異，即開環(huán)組甲基化水平顯著低于未開環(huán)組，提示對于血液樣本線粒體DNA甲基化的檢測，如果采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法，必須要先進(jìn)行開環(huán)處理，否則會過高地估計(jì)線粒體DN

11、A甲基化水平。
　　1.2.2漱口水樣本
　　在漱口水樣本中，對開環(huán)組和未開環(huán)組檢測成功的樣本的甲基化程度進(jìn)行比較分析，4條序列在未開環(huán)組的平均甲基化程度分別為1.17％±0.25％，1.79％±0.35％，0.47％±0.17％，1.06％±0.28％，而在開環(huán)組的平均甲基化程度分別為1.38％±0.21％，2.14％±0.29％，0.69％±0.18％，0.93％±0.22％，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明二者間的甲基

12、化水平無明顯差異。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)漱口水樣本線粒體DNA的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的影響較小，因此對甲基化定量數(shù)值的影響也不大，開環(huán)與否檢測結(jié)果無明顯差異。
　　2人類線粒體基因組DNA甲基化譜分析
　　應(yīng)用上述建立的BamHⅠ處理及亞硫酸氫鹽焦磷酸測序方法檢測了14個(gè)無關(guān)個(gè)體血液樣本及漱口水樣本的線粒體基因組甲基化，包括D環(huán)區(qū)的16個(gè)CpG位點(diǎn)、2個(gè)rRNA基因區(qū)的21個(gè)CpQ位點(diǎn)、6個(gè)蛋白質(zhì)基因的46個(gè)CpG位點(diǎn)，結(jié)

13、果發(fā)現(xiàn)，無論血液樣本還是漱口水樣本，無論D環(huán)區(qū)還是編碼區(qū)，這些位點(diǎn)在14個(gè)樣本的平均甲基化水平為0％～6％，且大部分為0％～2％，意味著幾乎沒有甲基化的發(fā)生。
　　結(jié)論:本研究首次采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序技術(shù)檢測人類線粒體基因組DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)mtDNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)影響亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)而影響后續(xù)的焦磷酸測序通過率，而且即使測序通過，其甲基化定量值明顯高于實(shí)際值，導(dǎo)致mtDNA甲基化程度被過高估計(jì)。這種現(xiàn)象在血液樣本表現(xiàn)突出，