苯亞慢性吸入對(duì)小鼠骨髓全基因組甲基化的影響.pdf

1、目的:苯是重要的工業(yè)生產(chǎn)原料和有機(jī)溶劑，廣泛應(yīng)用于合成樹脂、塑料、醫(yī)藥和制鞋等行業(yè)，同時(shí)也是香煙煙霧、裝修材料、以及原油和汽油等組成成分之一。因此，苯是職業(yè)環(huán)境和生活環(huán)境的常見污染物。苯易于揮發(fā)，通過呼吸道及皮膚黏膜進(jìn)入人體。短期接觸苯可對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用，引起急性中毒。長(zhǎng)期苯暴露可引起血液系統(tǒng)的多種疾病如白細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血、骨髓增生不良綜合征，甚至誘發(fā)白血病。因此對(duì)苯實(shí)施深入研究具有重要的社會(huì)意義。苯慢性毒性的主要靶

2、器官是骨髓，然而，其毒性機(jī)理迄今尚未完全闡明。以往苯的毒性機(jī)制研究多聚焦在代謝產(chǎn)物的遺傳毒性、自由基氧化損傷及相關(guān)基因多態(tài)性等方面。近年來研究表明表觀遺傳學(xué)的變異在苯介導(dǎo)的血液毒性中也起重要作用。盡管在苯的表觀遺傳毒性機(jī)制研究中已經(jīng)積累了一些證據(jù)，但對(duì)苯暴露引起的全基因組DNA甲基化的變化模式缺乏全面了解。本研究通過小鼠苯吸入染毒模型，應(yīng)用高密度基因芯片技術(shù)對(duì)亞慢性苯吸入染毒小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行了全基因組DNA甲基化掃描，旨在了解苯導(dǎo)致的

3、骨髓全基因組甲基化變異的全貌，通過比較不同暴露濃度小鼠骨髓細(xì)胞全基因組甲基化狀態(tài)，尋找苯暴露介導(dǎo)的甲基化差異基因，為闡明苯的毒性機(jī)制，預(yù)防和降低苯的危害提供理論依據(jù)。
　　方法:6～8w的C57BL/6J雄性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(0 ppm)、低濃度組(1 ppm)和高濃度組(100 ppm)。模擬職業(yè)苯暴露人群的暴露方式進(jìn)行8 hr/d，5 d/w，共計(jì)13w的亞慢性動(dòng)式吸入染毒。染毒結(jié)束后，處死小鼠，測(cè)量血液指標(biāo);分離股骨和脛

4、骨，提取骨髓基因組DNA(gDNA)。通過Roche-NimbleGen甲基化芯片(Mouse DNA Methylation3×720K CpG Island PlusRefSeq Promoter Array)篩選甲基化差異基因，通過差異甲基化基因的染色體分布、功能分類(Gene Ontology，GO)分析、信號(hào)通路(Signaling pathway)等分析方法，揭示苯暴露小鼠骨髓細(xì)胞全基因組甲基化模式和變化特征。
　　結(jié)

5、果:1.高濃度組小鼠體重顯著降低，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋和血小板均呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降。低濃度組小鼠體重?zé)o顯著變化，白細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)顯著下降。2.甲基化芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)控判斷:校正異常雜交信號(hào)，去除噪音信號(hào)，并通過對(duì)信號(hào)點(diǎn)MA-plot的分布明確信號(hào)值的均一性。掃描芯片灰度，成像完整，無團(tuán)塊和劃痕。結(jié)果表明雜交反應(yīng)成功、芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。
　　3.甲基化差異基因（片段）統(tǒng)計(jì):與對(duì)照組比較，低濃度組共有2106基因（2608個(gè)片段）的甲基

6、化程度發(fā)生改變，其中2084基因（2585片段）甲基化降低，22基因（23片段）甲基化水平升高。高濃度組共4206基因（5711片段）的甲基化水平發(fā)生改變，包括有4168基因（5672片段）降低，38基因（39片段）升高。兩個(gè)染毒組同時(shí)甲基化改變的有1248基因（1609片段），其中降低有1245基因（1606片段），升高的有3基因（3片段）。
　　4.甲基化變異片段在染色體上的分布及基因中的位置:幾乎所有染色體都有甲基化變異，且

7、甲基化變異片段多位于啟動(dòng)子的CpG島內(nèi)。
　　5.差異甲基化基因參與的信號(hào)通路分析和功能分類:結(jié)果顯示苯暴露導(dǎo)致小鼠骨髓甲基化變異的基因主要涉及的信號(hào)通路主要有Cytokine-cytokinereceptor interaction（發(fā)生甲基化差異的基因有26個(gè)）、MAPK signalingpathway(23個(gè))、Wnt signaling pathway(15個(gè))、Leukocyte transendothelialmig

8、ration（13個(gè)）、Hematopoietic cell lineage（10個(gè)）等。這些甲基化差異基因參與了包括DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、蛋白質(zhì)合成和翻譯后加工、發(fā)育、代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、細(xì)胞分化和凋亡、細(xì)胞通訊、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附等眾多生物過程。在差異甲基化基因中篩選了30個(gè)與造血功能密切相關(guān)且甲基化變異顯著的基因，進(jìn)一步進(jìn)行了聚類分析，為后續(xù)研究提供線索。
　　結(jié)論:亞慢性苯暴露可以導(dǎo)致小鼠骨髓全