全基因組DNA甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf

1、胃癌是嚴重危害我國居民身心健康的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于缺乏早期、特異、敏感的篩查和診斷指標，給胃癌的早期診斷和治療帶來極大的困難和挑戰(zhàn)。因此，加強對胃癌病因?qū)W、發(fā)病機制及預后因素的研究，篩選可靠的可用于預測胃癌發(fā)病及預后的生物標志物，對今后胃癌的預防、干預、治療和預后判斷均具有重要的意義。
　　胃癌的發(fā)生發(fā)展及臨床轉歸是涉及遺傳和表觀遺傳改變所致細胞調(diào)節(jié)和生長失控的多階段復雜過程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結果。大量的

2、流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)表明，幽門螺桿菌（Helico bacter pylori，HP）感染、飲食因素（高鹽、含N-亞硝基化合物、新鮮蔬菜和水果攝入不足）、吸煙、肥胖、家族遺傳史等都與胃癌的發(fā)生風險密切相關。各種環(huán)境危險因素在不同階段作用于不同基因，引起表觀遺傳的改變，繼而導致相關基因活性和表達水平的改變，這些基因環(huán)境之間的交互作用，最終導致胃癌的發(fā)生發(fā)展。機體參與環(huán)境應答的關鍵調(diào)控之一是基因組調(diào)控區(qū)域的甲基化，基因啟動子區(qū)的CpG島的甲基化

3、在調(diào)控基因表達方面發(fā)揮重要作用，但是在全基因組水平揭示DNA異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制的研究目前還很匱乏，而且基因調(diào)控區(qū)的異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并沒有被完全闡明。此外，位于基因調(diào)控區(qū)CpG島的遺傳變異(主要是單核苷酸多態(tài)性，SNP)是否可以調(diào)控表觀遺傳效應，共同參與胃癌的發(fā)生和臨床轉歸還有待進一步研究。本研究擬在全基因組水平探討表觀遺傳機制，以及遺傳與表觀遺傳的交互效應參與胃癌發(fā)生發(fā)展以及預后的分子機制，以期為胃癌的

4、早期預防、病因?qū)W研究以及預后判斷提供基礎研究證據(jù)。
　　第一部分高甲基化基因KCNMA1通過調(diào)控PTK2參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究
　　研究背景：
　　基因啟動子區(qū)的甲基化在調(diào)控基因表達方面發(fā)揮重要作用，由于啟動子高甲基化導致的抑癌基因失活，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。但是在全基因組水平揭示DNA異常甲基化參與胃癌發(fā)生發(fā)展機制的研究目前還很匱乏，所以在全基因組水平揭示胃癌發(fā)生過程中的甲基化水平差異顯得尤為必要和

5、迫切。
　　研究方法：
　　本研究收取12位胃癌患者的癌組織及其癌旁正常組織，提取組織DNA，亞硫酸鹽修飾后，采用Illumina Human甲基化450K芯片檢測胃癌患者癌與癌旁組織全基因組的甲基化水平差異，并采用甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR，MSP)和亞硫酸鹽測序法(bisulphite sequencing，BSP)的方法進一步驗證特異性CpG島在癌和癌旁的甲基化水平差異，然后通過

6、生物信息學，細胞表型實驗，以及動物實驗探索目的基因KCNMA1與下游靶基因之間的調(diào)控關系，最后使用Kaplan-Meier生存曲線評估KNMA1啟動子高甲基化對于胃癌預后的影響。
　　研究結果：
　　系統(tǒng)分析芯片結果發(fā)現(xiàn)，位于基因KCNMA1啟動子區(qū)的CpG位點cg24113782具有最顯著的統(tǒng)計學差異(P=0.006)，cg24113782參與調(diào)控基因KCNMA1在胃癌組織和胃癌細胞中的表達沉默。進一步在112對組織中驗證

7、發(fā)現(xiàn)，癌組織中KCNMA1基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的比例為66.7％(77/112)，而癌旁中發(fā)生甲基化的比例僅為16.2％(18/112)，生存分析提示KCNMA1啟動子區(qū)的高甲基化預示胃癌患者不良的預后結局(P=0.036)。體外實驗表明在胃癌細胞中過表達KCNMA1表達質(zhì)粒能明顯抑制細胞的增殖、侵襲、轉移等惡性表型(P＜0.001)，采用流式細胞儀研究發(fā)現(xiàn)KCNMA1主要是通過促進腫瘤細胞凋亡，進而調(diào)控細胞的惡性表型;裸鼠荷瘤實驗也

8、發(fā)現(xiàn)，過表達KCNMA1能明顯抑制腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖，過表達KCNMA1的瘤體生長速度明顯下降(P＜0.001)。進一步的研究我們發(fā)現(xiàn)KCNMA1發(fā)揮抑癌效應，主要是通過降低FAK凋亡通路促癌基因PTK2的表達，進而影響胃癌細胞凋亡進程實現(xiàn)的。
　　研究結論：
　　本項研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中啟動子區(qū)異常高甲基化基因KCNMA1通過調(diào)控PTK2的表達參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，它的啟動子區(qū)高甲基化是預測胃癌患者預后的獨立預測指標。<

9、br>　　第二部分基于全基因組的DNA甲基化相關SNPs(CpG-SNPs)與胃癌發(fā)病風險的關聯(lián)及其機制研究
　　研究背景：
　　大量的研究已經(jīng)證實位于基因組DNA上的SNPs可以影響其本身或者附近CpG位點的甲基化狀態(tài)，導致攜帶不同等位基因的個體，SNPs所在宿主CpG島甲基化水平的差異。SNPs可能通過改變其所在CpG島的甲基化狀態(tài)，干擾轉錄因子的結合，進而影響下游基因的轉錄調(diào)控，導致腫瘤的發(fā)生。因此，在全基因組水平探討

10、遺傳變異與表觀遺傳的交互效應，能夠為揭示胃癌發(fā)生風險相關SNPs位點的生物學功能開辟新的研究思路。
　　研究方法：
　　本研究結合胃癌全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)的數(shù)據(jù)，并通過ENCODE（encyclopedia of DNA elements）數(shù)據(jù)庫，獲得全基因組內(nèi)的所有CpG島的基因組物理位置，采用Illumina660W Quad chip對這個區(qū)域內(nèi)的所有

11、SNPs進行基因分型，并采用一系列分子生物學方法，探索顯著關聯(lián)SNPs調(diào)控其宿主CpG島的甲基化水平的分子機制，以及相關基因的分子功能。
　　研究結果:
　　首先對所有CpG島內(nèi)的SNPs進行基因分型，并計算其OR值和95％CI，采用Bonferroni校正后，發(fā)現(xiàn)位于假基因(pseudogene) GBAP1啟動子區(qū)的遺傳變異rs2990245與胃癌的發(fā)生風險顯著相關，在顯性模型中，相對于攜帶TT基因型的個體，攜帶CT和C

12、C基因型的個體罹患胃癌的風險減少20％(OR=0.80，95％CI=0.68-0.94，P=0.0076);隱性模型的結果也發(fā)現(xiàn)相對于攜帶TT和CT基因型的個體，攜帶CC基因型者發(fā)生胃癌的風險顯著降低(OR=0.40，95％CI=0.24-0.65，P=0.0002)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)rs2990245可以通過影響GBAP1的啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，進而調(diào)控GBAP1的表達。雙熒光實驗表明，rs2990245T等位基因的轉錄活性明顯高于C

13、等位基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)GBAP1在胃癌中顯著高表達，并且其在細胞質(zhì)中的表達明顯高于核內(nèi)的表達。更進一步的研究結果發(fā)現(xiàn)GBAP1可以扮演“內(nèi)源競爭性RNA”(competing endogenous RNAs，ceRNA)的角色，通過和其同源基因GBA競爭吸附miR-212-3p，解除miR-212-3p對GBA的抑制效應，上調(diào)基因GBA的表達。表達相關性分析發(fā)現(xiàn)，GBAP1與GBA在胃癌組織中的表達呈現(xiàn)顯著的正相關，且其表達相關性也被