二斑葉螨不同發(fā)育時(shí)期基因組DNA甲基化水平的研究.pdf

1、二斑葉螨TetranychusurticaeKoch和朱砂葉螨T.cinnabarinus(Boisduval)屬于蛛形綱Arachinida、蜱螨亞綱Acari、真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae，這兩種葉螨對(duì)果樹(shù)、溫室栽培植物和觀賞植物等有重大的危害，影響這些作物的生長(zhǎng)生產(chǎn)，是世界上重要的農(nóng)業(yè)害螨。葉螨的轉(zhuǎn)播方式極為多樣，它們可以爬行，也可以憑借風(fēng)力、水流、昆蟲(chóng)、鳥(niǎo)獸和農(nóng)業(yè)機(jī)具的傳帶等進(jìn)行擴(kuò)散。二斑葉螨和

2、朱砂葉螨在歐美被認(rèn)為是同一種螨類(lèi)，因?yàn)樵谶@兩種葉螨的形態(tài)學(xué)特征和線粒體DNA水平上難以找出差別;而在中國(guó)等亞洲國(guó)家則認(rèn)為這兩種葉螨是兩種不同的螨類(lèi)，因?yàn)槎呷~螨和朱砂葉螨的成螨體色差異較大，遺傳雜交實(shí)驗(yàn)常得到不親和的結(jié)果。因此，如何正確地區(qū)分這兩個(gè)近似種，在國(guó)內(nèi)外一直存在很大的爭(zhēng)議。前人為鑒別這兩種葉螨進(jìn)行了大量的研究:在形態(tài)學(xué)方面，主要以雌成螨的外部形態(tài)及雄螨生殖器形狀為依據(jù)鑒別兩種葉螨，但由于這些形態(tài)特征變異大、穩(wěn)定性低，所以很難從

3、形態(tài)學(xué)方面準(zhǔn)確鑒別;在雜交試驗(yàn)方面，由于研究人員來(lái)自不同國(guó)家，采用的葉螨地理種群不同，導(dǎo)致各雜交結(jié)果不一致，因此學(xué)者對(duì)二斑葉螨和朱砂葉螨的分類(lèi)地位仍各執(zhí)己見(jiàn);在分子標(biāo)記方面，應(yīng)用mtDNA、ITS和微衛(wèi)星等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)二斑葉螨和朱砂葉螨的進(jìn)化關(guān)系做了初步研究，但通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)仍然不能明確闡述這兩種葉螨的分類(lèi)進(jìn)化關(guān)系。因此，形態(tài)學(xué)的證據(jù)、雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和分子標(biāo)記技術(shù)的研究結(jié)果均不能對(duì)二斑葉螨和朱砂葉螨的分類(lèi)地位給出很好的定論。

4、　　前人的研究結(jié)果暗示了二斑葉螨和朱砂葉螨的基因組水平?jīng)]有差異，成螨體色上的顯著差異可能源自轉(zhuǎn)錄水平的差異，即由表觀遺傳調(diào)控造成的。研究表明，基因組DNA甲基化在對(duì)昆蟲(chóng)表型的改變中可能起著非常重要的作用。本研究首先以二斑葉螨為材料，以DNA甲基化研究為切入點(diǎn)，采用熒光標(biāo)記的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（F-MSAP,Fluorescence-labeledmethylation-sensitiveamplifiedpolymorphism）

5、對(duì)二斑葉螨不同發(fā)育時(shí)期（卵、幼螨、若螨、成螨）的基因組DNA甲基化水平及模式進(jìn)行檢測(cè)分析，初步建立葉螨基因組DNA甲基化水平的檢測(cè)體系，為進(jìn)一步比較二斑葉螨和朱砂葉螨的基因組DNA甲基化水平，探索基因組DNA甲基化對(duì)葉螨生長(zhǎng)發(fā)育的作用及與體色差異的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。
　　本研究的主要內(nèi)容以及取得的初步研究成果如下:
　　1、本研究共用了16對(duì)帶有熒光標(biāo)記的引物組合對(duì)中國(guó)福建二斑葉螨的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。這16對(duì)引物共擴(kuò)增出4

6、004個(gè)位點(diǎn)，每對(duì)引物能擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)量大約在30-85個(gè)之間，大多數(shù)位點(diǎn)分布在100bp-500bp之間。研究結(jié)果顯示三種甲基化模式:無(wú)甲基化(TypeⅠ)，半甲基化(TypeⅡ)，全甲基化(TypeⅢ)在四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期均有出現(xiàn)，其中，TypeⅠ位點(diǎn)共有3363個(gè)，TypeⅡ位點(diǎn)共有410個(gè)，TypeⅢ位點(diǎn)共有231個(gè)。
　　2、擴(kuò)增的總甲基化位點(diǎn)共有641個(gè)，其中半甲基化率(TypeⅡ)均高于全甲基化率(TypeⅢ)，各個(gè)發(fā)

7、育時(shí)期的平均總甲基化率(TypeⅡ+TypeⅢ)為16.01％，平均半甲基化率為10.24％，平均全甲基化率為5.77％。F-MSAP分析結(jié)果表明二斑葉螨不同發(fā)育時(shí)期的基因組DNA的甲基化水平和模式存在差異。
　　3、二斑葉螨四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（卵、幼螨、若螨、成螨）的總擴(kuò)增位點(diǎn)甲基化率分別為18.74％，17.91％，14.70％，12.86％;半甲基化率(TypeⅡ)分別為11.31％，12.17％，9.29％，8.29％;全甲

8、基化(TypeⅢ)率分別為7.43％，5.74％，5.41％，4.57％。各個(gè)發(fā)育時(shí)期二斑葉螨的胞嘧啶甲基化水平及各種甲基化模式所占比例不同，各個(gè)發(fā)育時(shí)期的半甲基化率均高于全甲基化率;二斑葉螨卵中總擴(kuò)增位點(diǎn)甲基化率(TypeⅡ+TypeⅢ)最高(18.74％)，成螨中最低(12.86％);幼螨中半甲基化率(TypeⅡ)最高(12.17％)，成螨中最低(8.29％);卵中全甲基化率(TypeⅢ)最高(7.43％)，成螨中最低(4.57％)