兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡基因組甲基化水平及LINe-1序列甲基化水平的研究.pdf

1、目的:
　　探討兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡(pediatric systemic lupus erythematosus，pSLE)患者基因組DNA甲基化水平在發(fā)病過程中的變化、LINE-1序列甲基化水平的變化及其與病情活動度、補體C3及血漿同型半胱氨酸的相關(guān)性。
　　方法:
　　一、對象為2010-2012年在我院風濕免疫科確診的pSLE患兒。選取pSLE患兒外周血單個核細胞的DNA標本為病例組，同期采集健康查體兒童DNA標

2、本為對照組。S LEDAI≥10分為疾病活動組，＜10分為相對靜止組;按年齡分為＜12歲和≥12歲組。取100 ng DNA標本，加入0.25 UBenzonase核酸酶，0.3 mU磷酸二酯酶Ⅰ和0.2 U堿磷酸酶，用Tris緩沖液控制pH值在7.9，37℃水解6小時。利用Agilent1200-6410B液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和Agilent ZORBAX SB-AQ C18(2.1×50 mm，3.5μ)色譜柱對水解后樣品分離定量。

3、優(yōu)化方法在5 min內(nèi)完成一份樣品檢測，并行方法的日內(nèi)穩(wěn)定和日間穩(wěn)定性評價，證明方法穩(wěn)定可靠。實際樣品進樣量為10μL，檢測模式為MRM模式。測定5mdC和dG的峰面積比。以dG為內(nèi)標，用標準曲線計算標本中DNA總體甲基化水平。
　　二、通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)聯(lián)合RNA堿基特異性剪切法(MassCLEAVE)測定外周血單個核細胞中LINE-1甲基化水平，以及應(yīng)用化學發(fā)光法測定血漿總同型半胱氨酸

4、(tHcy)水平。
　　結(jié)果:
　　一、病例組38例，男女比8∶30，年齡4-18歲，對照組30例，男女比11∶19，年齡8～18歲。病例組＜12歲16例，≥12歲22例;對照組＜12歲28例，≥12歲2例。SLEDAI≥10分12例，SLEDAI＜10分26例。病例組基因組DNA甲基化水平（5.89％±0.41％）低于對照組（6.75％±0.79％），差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.613，P＜0.001)。病例組按＜12歲組

5、與≥12歲組組間比較，其基因組DNA甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義，對照組依同樣方法分組比較，組間甲基化水平無明顯差異。分別比較兩組中男女間甲基化水平，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。SLEDAI＜10分和SLEDAI≥10分組分別與對照組比較，甲基化水平均存在差異(p＜0.001);SLEDAI＜10分和≥10分組之間差異無統(tǒng)計學意義(p=0.993)。
　　二、病例組59例，男女比16∶43，年齡4-18歲，對照組47例，男女比

6、16∶31;年齡6-18歲。pSLE病例組及健康對照組的LINE-1甲基化水平分別為60.93％及62.88％，二者比較差異顯著(p=0.001)。病例組LINE-1甲基化水平與SLEDAI評分相關(guān)（r=-0.285，P=0.032）。病例組LINE-1甲基化水平與C3顯著相關(guān)(r=0.317，P=0.044)。低甲基化水平者pSLE發(fā)病風險升高(AOR:14.5;95％ CI:2.8，75.6)。病例組血漿同型半胱氨酸水平顯著高于對照