葉酸缺乏對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎發(fā)育的影響及其對(duì)基因組甲基化模式的調(diào)控.pdf

1、目的：妊娠結(jié)局與環(huán)境因素密切相關(guān)，母體飲食可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控對(duì)胚胎發(fā)育及子代的表型產(chǎn)生影響。葉酸作為哺乳動(dòng)物不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素，參與DNA合成及甲基化反應(yīng)等重要生理過(guò)程。葉酸缺乏或代謝障礙可改變基因組甲基化模式，影響基因的表達(dá)或功能，導(dǎo)致病理過(guò)程的發(fā)生。以往關(guān)于葉酸在妊娠中的作用研究多集中于葉酸代謝酶與胚胎發(fā)育的關(guān)系，但現(xiàn)有研究成果在深入闡釋葉酸缺乏誘發(fā)胚胎發(fā)育異常的分子機(jī)制中仍顯不足，關(guān)于葉酸在妊娠早期子宮內(nèi)微環(huán)境中的作用報(bào)道甚少。課

2、題組前期研究發(fā)現(xiàn)母體低葉酸水平并未對(duì)子宮內(nèi)膜容受性造成不良影響，因此，本研究旨在探討以下問(wèn)題：1.葉酸缺乏對(duì)后續(xù)子宮內(nèi)膜功能即子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化和胚胎發(fā)育的影響；2.葉酸缺乏是否會(huì)通過(guò)改變相關(guān)基因的甲基化模式對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響？3.平面細(xì)胞極性信號(hào)通路（planar cell polarity pathway，PCP）作為神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路，母體低葉酸水平是否影響其核心基因的表達(dá)與功能？本文將分別從母

3、體與胚胎兩方面闡明葉酸缺乏對(duì)妊娠過(guò)程的影響及其對(duì)基因組甲基化模式的調(diào)控，以全面了解葉酸在妊娠過(guò)程中的作用，為調(diào)整育齡女性補(bǔ)充葉酸的時(shí)機(jī)、完善葉酸作用的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型建立及標(biāo)本收集：采用無(wú)葉酸飼料飼養(yǎng)小鼠5周，對(duì)照組正常飲食。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)小鼠血清葉酸水平，確定葉酸缺乏小鼠模型是否建立成功。
　　正常妊娠模型：將雌鼠與正常性成熟雄鼠合籠交配，以次日查見(jiàn)陰栓記為孕1天（D1）。正

4、常組與葉酸缺乏組小鼠于正常妊娠6到13天（D6-D13）脫頸處死，收集子宮內(nèi)膜及胚胎組織。
　　人工誘導(dǎo)蛻膜化模型：將雌鼠與結(jié)扎輸精管的雄鼠合籠交配，以次日查見(jiàn)陰栓記為假孕第1天（PD1），小鼠假孕4天（PD4）一側(cè)宮角注射玉米油誘導(dǎo)蛻膜化，對(duì)側(cè)宮角不注射作為對(duì)照，正常組與葉酸缺乏組小鼠于PD8處死，收集子宮組織。
　　2.葉酸缺乏效應(yīng)觀察：
　　1）子宮內(nèi)膜蛻膜化檢測(cè)：對(duì)小鼠蛻膜化時(shí)期（D6-D8）子宮外觀進(jìn)行觀察，

5、統(tǒng)計(jì)蛻膜鼓包數(shù)目及直徑。借助人工誘導(dǎo)蛻膜化模型進(jìn)行體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，通過(guò)觀察子宮外觀、稱(chēng)量子宮濕重、HE染色觀察子宮切片形態(tài)及Real-time PCR檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子Bmp2、dtPRP的mRNA水平來(lái)衡量人工誘導(dǎo)蛻膜化是否成功，統(tǒng)計(jì)兩組小鼠誘導(dǎo)成功率。體外功能實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離小鼠原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，利用雌孕激素誘導(dǎo)蛻膜化實(shí)現(xiàn)，采用Real-time PCR檢測(cè)Bmp2、dtPRP的mRNA表達(dá)，利用免疫熒光檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子Desmin

6、的蛋白表達(dá)。
　　2）生殖能力及胚胎發(fā)育狀態(tài)檢測(cè)：對(duì)兩組小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，比較產(chǎn)仔能力。觀察 D9-D13小鼠子宮外觀和胚胎形態(tài)，利用HE染色觀察宮腔內(nèi)胚胎發(fā)育狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)子宮濕重和胚胎吸收率。
　　3.基因組甲基化模式檢測(cè)：采用簡(jiǎn)化代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Reduced Representation Bisulphite Sequencing，RRBS)對(duì)正常組和葉酸缺乏組小鼠D6-D8子宮內(nèi)膜、D9-D11胚胎組織的全基因

7、組甲基化模式進(jìn)行檢測(cè)，分析其甲基化差異，統(tǒng)計(jì)兩組之間存在的差異甲基化區(qū)域（Differentially Methylated Regions，DMRs），利用生物信息學(xué)方法（GO分析）對(duì)差異甲基化基因進(jìn)行功能聚類(lèi)。采用Real-time PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果中涉及的差異甲基化基因的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　4. PCP信號(hào)通路分析：分別采用Real-time PCR、Western blot對(duì)兩組小鼠 D9-D12胚胎組織中 PCP

8、信號(hào)通路核心基因 Vangl（Vangl1和Vangl2）的 mRNA、蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。采用免疫共沉淀方法檢測(cè)正常組和葉酸缺乏組小鼠D9、D10胚胎組織中Vangl基因與其配體Dvl蛋白的相互作用。采用亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）法對(duì)兩組小鼠D9胚胎組織中Vangl1、Vangl2基因啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。利用直接測(cè)序法對(duì)兩組小鼠 D9-D13胚胎組織中 Vangl基因（Vangl1和 Vangl2）CDS區(qū)進(jìn)行測(cè)序

9、分析，再經(jīng)比對(duì) NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選Vangl基因突變或SNP位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.葉酸缺乏對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響：蛻膜化時(shí)期子宮外觀觀察結(jié)果顯示，與正常組相比，葉酸缺乏組小鼠蛻膜鼓包數(shù)目減少、直徑較小。人工誘導(dǎo)蛻膜化模型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，葉酸缺乏組小鼠成功率僅15％；誘導(dǎo)側(cè)宮角濕重較正常組小鼠減輕；HE染色結(jié)果顯示正常組小鼠誘導(dǎo)側(cè)可見(jiàn)體積增大、雙核或多核的蛻膜細(xì)胞，葉酸缺乏組小鼠無(wú)類(lèi)似變化；Real-time PCR

10、結(jié)果表明，葉酸缺乏組小鼠誘導(dǎo)蛻膜化后，蛻膜化marker Bmp2、dtPRP的mRNA水平較正常組小鼠顯著降低。體外功能實(shí)驗(yàn)顯示，正常組小鼠基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)激素作用72h后，細(xì)胞變大，由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切?，而葉酸缺乏狀態(tài)下，基質(zhì)細(xì)胞仍呈成纖維細(xì)胞樣；Real-time PCR結(jié)果顯示，葉酸缺乏組小鼠基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)激素誘導(dǎo)后Bmp2、dtPRP的mRNA較正常組細(xì)胞表達(dá)減少；免疫熒光結(jié)果顯示，蛻膜化marker Desmin蛋白陽(yáng)性信號(hào)在葉酸缺乏組

11、細(xì)胞顯著減弱。
　　2.葉酸缺乏對(duì)胚胎發(fā)育的影響：飼養(yǎng)結(jié)果表明，葉酸缺乏狀態(tài)下的小鼠產(chǎn)仔窩數(shù)及產(chǎn)仔個(gè)數(shù)顯著減少。葉酸缺乏組小鼠自D10開(kāi)始出現(xiàn)子宮出血，D11出血加重，D12、D13胚胎吸收明顯。與正常組相比，葉酸缺乏組小鼠子宮濕重自D10開(kāi)始下降，隨妊娠進(jìn)行下降更為明顯。葉酸缺乏組小鼠的胚胎吸收率高達(dá)70%。正常組小鼠胚胎隨妊娠天數(shù)增加生長(zhǎng)分化呈現(xiàn)可辨認(rèn)的仔鼠形態(tài)，而葉酸缺乏組小鼠胚胎出現(xiàn)生長(zhǎng)粘連、分化發(fā)育異常。
　　3.

12、葉酸缺乏對(duì)基因組甲基化模式的影響：RRBS結(jié)果顯示，兩組小鼠子宮內(nèi)膜基因組在D6、D7啟動(dòng)子區(qū)和CGI區(qū)的不同類(lèi)型mC（包括mCG和mCHG, mCHH，其中H代表A、G或T）分布比例類(lèi)似， D8葉酸缺乏組小鼠mCG比例增加而mCHH比例下降；胚胎組織基因組在D9、D10啟動(dòng)子區(qū)和CpG島（CGI）區(qū)的不同類(lèi)型mC分布比例類(lèi)似，D11葉酸缺乏組小鼠mCG比例增加而mCHH比例下降。與正常組相比，葉酸缺乏組小鼠子宮內(nèi)膜組織中總 C的平均甲

13、基化水平在D7開(kāi)始下降，D8下降更為明顯，而mC的平均甲基化水平則在D8出現(xiàn)降低；胚胎組織基因組總C的平均甲基化水平在孕10天開(kāi)始下降，孕11天下降更為明顯，而mC的平均甲基化水平在D9-D11均高于正常組，但mCG在葉酸缺乏組的甲基化水平仍有所降低；甲基化水平的差異均集中于CG和mCG。對(duì)兩組之間的差異甲基化區(qū)域統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，D6、D7和D8子宮內(nèi)膜組織基因組分別存在666個(gè)、646個(gè)和785個(gè)DMRs；D9、D10和D11胚胎組織基

14、因組分別存在795個(gè)、2480個(gè)和1602個(gè)DMRs。GO分析結(jié)果顯示，D6-D8差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因主要涉及生物粘附、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、發(fā)育代謝和信號(hào)通路功能；D9-D11差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因主要涉及生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過(guò)程、發(fā)育代謝、應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)通路功能。Real-time PCR結(jié)果顯示，兩組間存在甲基化差異的基因，其mRNA水平也發(fā)生變化。
　　4.葉酸缺乏對(duì)PCP信號(hào)通路的影響：Real-time PCR、Wester

15、n blot結(jié)果顯示，葉酸缺乏組小鼠胚胎組織中Vangl1和Vangl2的mRNA及蛋白水平自D9開(kāi)始出現(xiàn)下降，并隨妊娠進(jìn)行下調(diào)更為明顯。免疫共沉淀結(jié)果顯示，葉酸缺乏的情況下，小鼠胚胎組織中Vangl1蛋白與Dvl1的相互作用被抑制，而與Dvl2、Dvl3的結(jié)合未受影響；而Vangl2蛋白與Dvl1、Dvl2、Dvl3的結(jié)合均被葉酸缺乏抑制。BSP測(cè)序結(jié)果顯示，葉酸缺乏組小鼠D9胚胎組織中Vangl基因甲基化率較正常組無(wú)顯著差異。CDS

16、測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠和葉酸缺乏組小鼠 D9-D13胚胎組織中 Vangl基因存在三個(gè) SNP位點(diǎn)，分別是Vangl1基因SNP位點(diǎn)rs36584696、Vangl2基因SNP位點(diǎn)rs48000091和rs31578570。
　　結(jié)論：
　　1.葉酸缺乏抑制小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化進(jìn)程，同時(shí)引起子宮內(nèi)膜基因組甲基化模式的改變，包括不同類(lèi)型 mC的分布和平均甲基化水平，從而影響關(guān)鍵基因的表達(dá)和功能，這

17、可能是低葉酸水平導(dǎo)致蛻膜化進(jìn)程受阻的潛在分子機(jī)制。母體葉酸攝入不足在妊娠早期即發(fā)揮作用，以上數(shù)據(jù)為調(diào)整補(bǔ)充葉酸的時(shí)機(jī)提供了基礎(chǔ)研究證據(jù)。
　　2.葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠生殖能力嚴(yán)重受損，胚胎發(fā)育停滯，同時(shí)改變胚胎基因組的甲基化模式，包括不同類(lèi)型 mC的分布和甲基化水平，影響發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。
　　3.葉酸缺乏會(huì)抑制PCP信號(hào)通路核心基因Vangl基因的表達(dá)及功能，其作用機(jī)制不依賴于 DNA甲基化，葉酸攝入不足可能不會(huì)引起Van