葉酸缺乏對小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎發(fā)育的影響及其對基因組甲基化模式的調控.pdf

1、目的：妊娠結局與環(huán)境因素密切相關，母體飲食可通過表觀遺傳調控對胚胎發(fā)育及子代的表型產(chǎn)生影響。葉酸作為哺乳動物不可或缺的營養(yǎng)元素，參與DNA合成及甲基化反應等重要生理過程。葉酸缺乏或代謝障礙可改變基因組甲基化模式，影響基因的表達或功能，導致病理過程的發(fā)生。以往關于葉酸在妊娠中的作用研究多集中于葉酸代謝酶與胚胎發(fā)育的關系，但現(xiàn)有研究成果在深入闡釋葉酸缺乏誘發(fā)胚胎發(fā)育異常的分子機制中仍顯不足，關于葉酸在妊娠早期子宮內(nèi)微環(huán)境中的作用報道甚少。課

2、題組前期研究發(fā)現(xiàn)母體低葉酸水平并未對子宮內(nèi)膜容受性造成不良影響，因此，本研究旨在探討以下問題：1.葉酸缺乏對后續(xù)子宮內(nèi)膜功能即子宮內(nèi)膜基質細胞的蛻膜化和胚胎發(fā)育的影響；2.葉酸缺乏是否會通過改變相關基因的甲基化模式對子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響？3.平面細胞極性信號通路（planar cell polarity pathway，PCP）作為神經(jīng)管發(fā)育過程的關鍵信號通路，母體低葉酸水平是否影響其核心基因的表達與功能？本文將分別從母

3、體與胚胎兩方面闡明葉酸缺乏對妊娠過程的影響及其對基因組甲基化模式的調控，以全面了解葉酸在妊娠過程中的作用，為調整育齡女性補充葉酸的時機、完善葉酸作用的分子機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.動物模型建立及標本收集：采用無葉酸飼料飼養(yǎng)小鼠5周，對照組正常飲食。采用電化學發(fā)光法檢測小鼠血清葉酸水平，確定葉酸缺乏小鼠模型是否建立成功。
　　正常妊娠模型：將雌鼠與正常性成熟雄鼠合籠交配，以次日查見陰栓記為孕1天（D1）。正

4、常組與葉酸缺乏組小鼠于正常妊娠6到13天（D6-D13）脫頸處死，收集子宮內(nèi)膜及胚胎組織。
　　人工誘導蛻膜化模型：將雌鼠與結扎輸精管的雄鼠合籠交配，以次日查見陰栓記為假孕第1天（PD1），小鼠假孕4天（PD4）一側宮角注射玉米油誘導蛻膜化，對側宮角不注射作為對照，正常組與葉酸缺乏組小鼠于PD8處死，收集子宮組織。
　　2.葉酸缺乏效應觀察：
　　1）子宮內(nèi)膜蛻膜化檢測：對小鼠蛻膜化時期（D6-D8）子宮外觀進行觀察，

5、統(tǒng)計蛻膜鼓包數(shù)目及直徑。借助人工誘導蛻膜化模型進行體內(nèi)功能實驗，通過觀察子宮外觀、稱量子宮濕重、HE染色觀察子宮切片形態(tài)及Real-time PCR檢測蛻膜化標志分子Bmp2、dtPRP的mRNA水平來衡量人工誘導蛻膜化是否成功，統(tǒng)計兩組小鼠誘導成功率。體外功能實驗通過分離小鼠原代子宮內(nèi)膜基質細胞，利用雌孕激素誘導蛻膜化實現(xiàn)，采用Real-time PCR檢測Bmp2、dtPRP的mRNA表達，利用免疫熒光檢測蛻膜化標志分子Desmin

6、的蛋白表達。
　　2）生殖能力及胚胎發(fā)育狀態(tài)檢測：對兩組小鼠進行飼養(yǎng)繁殖，比較產(chǎn)仔能力。觀察 D9-D13小鼠子宮外觀和胚胎形態(tài)，利用HE染色觀察宮腔內(nèi)胚胎發(fā)育狀態(tài)，統(tǒng)計子宮濕重和胚胎吸收率。
　　3.基因組甲基化模式檢測：采用簡化代表性亞硫酸氫鹽測序法（Reduced Representation Bisulphite Sequencing，RRBS)對正常組和葉酸缺乏組小鼠D6-D8子宮內(nèi)膜、D9-D11胚胎組織的全基因

7、組甲基化模式進行檢測，分析其甲基化差異，統(tǒng)計兩組之間存在的差異甲基化區(qū)域（Differentially Methylated Regions，DMRs），利用生物信息學方法（GO分析）對差異甲基化基因進行功能聚類。采用Real-time PCR對測序結果中涉及的差異甲基化基因的mRNA水平進行檢測。
　　4. PCP信號通路分析：分別采用Real-time PCR、Western blot對兩組小鼠 D9-D12胚胎組織中 PCP

8、信號通路核心基因 Vangl（Vangl1和Vangl2）的 mRNA、蛋白水平進行檢測。采用免疫共沉淀方法檢測正常組和葉酸缺乏組小鼠D9、D10胚胎組織中Vangl基因與其配體Dvl蛋白的相互作用。采用亞硫酸氫鹽測序（BSP）法對兩組小鼠D9胚胎組織中Vangl1、Vangl2基因啟動子區(qū)和第一外顯子區(qū)的甲基化狀態(tài)進行檢測。利用直接測序法對兩組小鼠 D9-D13胚胎組織中 Vangl基因（Vangl1和 Vangl2）CDS區(qū)進行測序

9、分析，再經(jīng)比對 NCBI公共數(shù)據(jù)庫，篩選Vangl基因突變或SNP位點。
　　結果：
　　1.葉酸缺乏對子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響：蛻膜化時期子宮外觀觀察結果顯示，與正常組相比，葉酸缺乏組小鼠蛻膜鼓包數(shù)目減少、直徑較小。人工誘導蛻膜化模型統(tǒng)計結果顯示，葉酸缺乏組小鼠成功率僅15％；誘導側宮角濕重較正常組小鼠減輕；HE染色結果顯示正常組小鼠誘導側可見體積增大、雙核或多核的蛻膜細胞，葉酸缺乏組小鼠無類似變化；Real-time PCR

10、結果表明，葉酸缺乏組小鼠誘導蛻膜化后，蛻膜化marker Bmp2、dtPRP的mRNA水平較正常組小鼠顯著降低。體外功能實驗顯示，正常組小鼠基質細胞經(jīng)激素作用72h后，細胞變大，由長梭形變?yōu)槎嘟切危~酸缺乏狀態(tài)下，基質細胞仍呈成纖維細胞樣；Real-time PCR結果顯示，葉酸缺乏組小鼠基質細胞經(jīng)激素誘導后Bmp2、dtPRP的mRNA較正常組細胞表達減少；免疫熒光結果顯示，蛻膜化marker Desmin蛋白陽性信號在葉酸缺乏組

11、細胞顯著減弱。
　　2.葉酸缺乏對胚胎發(fā)育的影響：飼養(yǎng)結果表明，葉酸缺乏狀態(tài)下的小鼠產(chǎn)仔窩數(shù)及產(chǎn)仔個數(shù)顯著減少。葉酸缺乏組小鼠自D10開始出現(xiàn)子宮出血，D11出血加重，D12、D13胚胎吸收明顯。與正常組相比，葉酸缺乏組小鼠子宮濕重自D10開始下降，隨妊娠進行下降更為明顯。葉酸缺乏組小鼠的胚胎吸收率高達70%。正常組小鼠胚胎隨妊娠天數(shù)增加生長分化呈現(xiàn)可辨認的仔鼠形態(tài)，而葉酸缺乏組小鼠胚胎出現(xiàn)生長粘連、分化發(fā)育異常。
　　3.

12、葉酸缺乏對基因組甲基化模式的影響：RRBS結果顯示，兩組小鼠子宮內(nèi)膜基因組在D6、D7啟動子區(qū)和CGI區(qū)的不同類型mC（包括mCG和mCHG, mCHH，其中H代表A、G或T）分布比例類似， D8葉酸缺乏組小鼠mCG比例增加而mCHH比例下降；胚胎組織基因組在D9、D10啟動子區(qū)和CpG島（CGI）區(qū)的不同類型mC分布比例類似，D11葉酸缺乏組小鼠mCG比例增加而mCHH比例下降。與正常組相比，葉酸缺乏組小鼠子宮內(nèi)膜組織中總 C的平均甲

13、基化水平在D7開始下降，D8下降更為明顯，而mC的平均甲基化水平則在D8出現(xiàn)降低；胚胎組織基因組總C的平均甲基化水平在孕10天開始下降，孕11天下降更為明顯，而mC的平均甲基化水平在D9-D11均高于正常組，但mCG在葉酸缺乏組的甲基化水平仍有所降低；甲基化水平的差異均集中于CG和mCG。對兩組之間的差異甲基化區(qū)域統(tǒng)計結果顯示，D6、D7和D8子宮內(nèi)膜組織基因組分別存在666個、646個和785個DMRs；D9、D10和D11胚胎組織基

14、因組分別存在795個、2480個和1602個DMRs。GO分析結果顯示，D6-D8差異甲基化區(qū)域相關基因主要涉及生物粘附、生物調節(jié)、細胞增殖、發(fā)育代謝和信號通路功能；D9-D11差異甲基化區(qū)域相關基因主要涉及生物調節(jié)、細胞過程、發(fā)育代謝、應激反應和信號通路功能。Real-time PCR結果顯示，兩組間存在甲基化差異的基因，其mRNA水平也發(fā)生變化。
　　4.葉酸缺乏對PCP信號通路的影響：Real-time PCR、Wester

15、n blot結果顯示，葉酸缺乏組小鼠胚胎組織中Vangl1和Vangl2的mRNA及蛋白水平自D9開始出現(xiàn)下降，并隨妊娠進行下調更為明顯。免疫共沉淀結果顯示，葉酸缺乏的情況下，小鼠胚胎組織中Vangl1蛋白與Dvl1的相互作用被抑制，而與Dvl2、Dvl3的結合未受影響；而Vangl2蛋白與Dvl1、Dvl2、Dvl3的結合均被葉酸缺乏抑制。BSP測序結果顯示，葉酸缺乏組小鼠D9胚胎組織中Vangl基因甲基化率較正常組無顯著差異。CDS

16、測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠和葉酸缺乏組小鼠 D9-D13胚胎組織中 Vangl基因存在三個 SNP位點，分別是Vangl1基因SNP位點rs36584696、Vangl2基因SNP位點rs48000091和rs31578570。
　　結論：
　　1.葉酸缺乏抑制小鼠子宮內(nèi)膜基質細胞的蛻膜化進程，同時引起子宮內(nèi)膜基因組甲基化模式的改變，包括不同類型 mC的分布和平均甲基化水平，從而影響關鍵基因的表達和功能，這

17、可能是低葉酸水平導致蛻膜化進程受阻的潛在分子機制。母體葉酸攝入不足在妊娠早期即發(fā)揮作用，以上數(shù)據(jù)為調整補充葉酸的時機提供了基礎研究證據(jù)。
　　2.葉酸缺乏會導致小鼠生殖能力嚴重受損，胚胎發(fā)育停滯，同時改變胚胎基因組的甲基化模式，包括不同類型 mC的分布和甲基化水平，影響發(fā)育相關基因的表達。
　　3.葉酸缺乏會抑制PCP信號通路核心基因Vangl基因的表達及功能，其作用機制不依賴于 DNA甲基化，葉酸攝入不足可能不會引起Van