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文檔簡介
1、子宮內膜在卵巢排卵后及妊娠期間為準備及維持妊娠而發(fā)生的一系列重塑反應稱為蛻膜化(Decidualization),狹義的蛻膜化定義是內膜間質細胞在雌、孕激素作用下發(fā)生的形態(tài)學、生物化學方面的變化。蛻膜化過程伴隨著內膜腔上皮細胞、間質細胞、淋巴細胞、細胞外基質和血管結構的一系列適應性改變。蛻膜功能的正常表達在胚胎著床、妊娠的建立與維持,以及分娩發(fā)動均起著重要的作用,研究其生長、退化和調控,對于明確胚胎著床機制和生育調節(jié)具有重要的意義。
2、r> 復發(fā)性流產是產科領域常見問題,一直困擾著廣大醫(yī)生和患者,其病因復雜。近幾年來有學者認為,復發(fā)性流產患者子宮內膜間質細胞蛻膜化能力降低,導致胚胎著床“窗口期”延長、損傷胚胎或者對異常胚胎識別能力減低而發(fā)病,但是蛻膜化降低的原因和機制目前尚不清楚。
Lefty基因是轉化生長因子β超家族成員中為數不多的抑制劑之一,屬于細胞信號分子,Lefty基因及其下游smad通路參與胚胎干細胞分化、胚胎發(fā)育等早發(fā)事件。Lefty基因在人類
3、分泌晚期及月經期的子宮內膜中特異性表達,可以誘導增生期子宮內膜細胞分泌表達基質金屬蛋白酶3、7、9,參與周期性的內膜基質分解及脫落調節(jié)過程。但在胚胎著床期的子宮內膜,Lefty基因卻無表達;同樣的研究發(fā)現在子宮內膜異位癥或子宮腺肌癥所致不孕患者的內膜中,Lefty蛋白的不成熟形式,即分子量為44kDa多肽大量表達。在小鼠的整個月經周期及妊娠1-3天內,Leftym RNA及蛋白均有表達,妊娠第9天消失;但Lefty基因轉染內膜后,小鼠胚
4、胎著床率明顯減少。Lefty在子宮內膜中這種特殊的表達方式,提示其與子宮內膜蛻膜化有關。但是在人類子宮蛻膜中,隨著妊娠的建立及維持,Lefty是否表達及變化趨勢,目前尚未見報道。因此,我們擬通過PCR、Western blotting等生物化學方法,檢測Lefty在早期復發(fā)性流產子宮蛻膜組織中的表達,證明Lefty在復發(fā)性流產蛻膜組織中表達增加,參與了復發(fā)性流產蛻膜化受損過程。
子宮蛻膜化反應最明顯的特征是內膜間質細胞增殖、分
5、化成多倍體蛻膜細胞,細胞形態(tài)表現為大的單核或雙核細胞,DNA增加4倍、8倍、或者更多倍,表明細胞經過了核內復制而不是細胞分裂。核內復制的特點提示我們在間質細胞蛻膜化過程中,細胞周期的改變導致DNA復制而無細胞分裂。在生殖周期中,子宮受到雌孕激素的調節(jié),其中細胞周期調節(jié)因子也因發(fā)生周期性改變而發(fā)揮作用。在增殖期子宮內膜上皮細胞及間質細胞,特殊的周期素及周期素依賴鏈激酶表達增加,而在分泌期,P57等細胞周期調節(jié)因子在孕激素作用下表達增加。關
6、于Lefty在蛻膜化過程中與細胞周期關系的研究極少。因此,我們擬通過基因重組、RNA干擾等分子生物學方法,檢測體外間質細胞蛻膜化誘導過程中細胞周期因子cyclinD1及P57的表達,證明Lefty基因通過調控細胞周期來抑制間質細胞蛻膜化。
方法:
一、Lefty在早期復發(fā)性流產、正常早期妊娠子宮蛻膜中的表達
1、PCR方法檢測早期復發(fā)性流產、正常早期妊娠的子宮蛻膜中Lefty mRNA的表達水平。
7、 2、免疫組織化學法、Western Blotting法檢測早期復發(fā)性流產、正常早期妊娠的子宮蛻膜中Lefty蛋白表達。
二、Lefty基因在子宮內膜間質細胞(hESC)蛻膜化過程中的表達及作用
1、原代培養(yǎng)人子宮內膜間質細胞(hESC)并進行傳代。
2、免疫細胞化學染色鑒定hESC細胞。
3、hESC體外蛻膜化誘導及蛻膜化標志物PRL、IGFBP-1檢測。
4、構建pc-DNA3.1(
8、+)Lefty過表達載體,酶切鑒定及測序,瞬時轉染誘導48h的hESC。
5、靶向hESC中Lefty基因的SiRNA干擾及篩選,瞬時轉染誘導48h的hESC。
6、熒光定量PCR、Western Blotting檢測Lefty mRNA及蛋白表達,驗證pcDNA3.1(+)-Lefty、SiRNA轉染效率。
7、Western Blotting檢測各組hESCs中P57、cyclinD1表達水平。
9、 8、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組hESCs上清液中PRL、IGFBP-1的含量。
9、流式細胞儀檢測Lefty基因對細胞周期的影響。
結果:
一、Lefty在早期復發(fā)性流產及正常早期妊娠子宮蛻膜中的表達
1、PCR結果表明:妊娠早期子宮蛻膜Lefty mRNA相對表達水平為0.64±0.07,明顯低于復發(fā)性流產組子宮蛻膜1.04±0.12(P<0.05)。
2、免疫組織化學
10、結果表明:Lefty在子宮蛻膜組織的間質細胞漿內表達,在妊娠早期子宮蛻膜陽性表達率為20.0%,明顯低于復發(fā)性流產組85%(P<0.05)。
3、Western blotting結果表明:在早期復發(fā)性流產及正常早期妊娠子宮蛻膜內,Lefty蛋白均以裂解后的分子量為34kDa活性蛋白形式出現。
二、Lefty基因在人子宮內膜間質細胞(hESC)蛻膜化中的作用
1、體外成功分離和培養(yǎng)人子宮內膜間質細胞(hESC
11、)。
2、免疫細胞化學染色鑒定結果表明細胞波形蛋白染色陽性,CD10染色陽性,角蛋白、Ⅷ因子及白細胞共同抗原染色均陰性,證實為人子宮內膜間質細胞。
3、在MPA和8-Br-cAMP誘導下,hESC逐漸增大、變圓,胞漿透亮,細胞核增大。ELISA結果表明,培養(yǎng)上清液中的PRL和IGFBP-1在誘導第4天明顯增加,證實體外間質細胞蛻膜化誘導成功。
4、構建pcDNA3.1(+)-Lefty過表達載體,序列鑒定證
12、實。篩選SiRNA片段,其中Lefty-homo-872使用量50nM沉默效率最高,為86.63%。
5、熒光定量PCR及Western blotting結果表明:hESC轉染Lefty過表達載體后,Lefty mRNA及蛋白明顯增加;hESC轉染SiRNA后,Lefty mRNA及蛋白明顯降低。hESC蛻膜化誘導后,Lefty未成熟蛋白減少,成熟蛋白增加。
6、ELISA結果表明:hESCs轉染Lefty過表達載體
13、后誘導,PRL、IGFBP-1分泌量明顯降低;hESCs轉染Lefty siRNA后誘導,PRL、IGFBP-1分泌量明顯增加。
7、流式細胞儀檢測結果表明:hESCs蛻膜化誘導后,S期細胞比例明顯減少,G0/1期細胞比例明顯增加,發(fā)生G0/1至S期阻滯。hESCs轉染Lefty過表達載體后,能夠明顯逆轉已經發(fā)生的G0/1至S期阻滯。
8、Western blotting結果表明:hESCs蛻膜化誘導后,P57蛋白增
14、加,Cyclin D1蛋白下降;轉染Lefty過表達載體后誘導,P57、Cyclin D1蛋白無明顯變化,轉染Lefty SiRNA后誘導,P57蛋白明顯上調,CyclinD1蛋白明顯下降。
結論:
1、Lefty基因及蛋白在早期復發(fā)性流產蛻膜組織內表達增加,可能通過抑制子宮內膜蛻膜化反應,參與早期復發(fā)性流產的發(fā)病過程。
2、Lefty基因通過調控cyclinD1及P57的表達來調節(jié)、控制細胞周期、從而抑制
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