Lefty基因在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜在卵巢排卵后及妊娠期間為準備及維持妊娠而發(fā)生的一系列重塑反應(yīng)稱為蛻膜化(Decidualization)，狹義的蛻膜化定義是內(nèi)膜間質(zhì)細胞在雌、孕激素作用下發(fā)生的形態(tài)學、生物化學方面的變化。蛻膜化過程伴隨著內(nèi)膜腔上皮細胞、間質(zhì)細胞、淋巴細胞、細胞外基質(zhì)和血管結(jié)構(gòu)的一系列適應(yīng)性改變。蛻膜功能的正常表達在胚胎著床、妊娠的建立與維持，以及分娩發(fā)動均起著重要的作用，研究其生長、退化和調(diào)控，對于明確胚胎著床機制和生育調(diào)節(jié)具有重要的意義。

2、r>　　復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是產(chǎn)科領(lǐng)域常見問題，一直困擾著廣大醫(yī)生和患者，其病因復(fù)雜。近幾年來有學者認為，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞蛻膜化能力降低，導(dǎo)致胚胎著床“窗口期”延長、損傷胚胎或者對異常胚胎識別能力減低而發(fā)病，但是蛻膜化降低的原因和機制目前尚不清楚。
　　Lefty基因是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員中為數(shù)不多的抑制劑之一，屬于細胞信號分子，Lefty基因及其下游smad通路參與胚胎干細胞分化、胚胎發(fā)育等早發(fā)事件。Lefty基因在人類

3、分泌晚期及月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜中特異性表達，可以誘導(dǎo)增生期子宮內(nèi)膜細胞分泌表達基質(zhì)金屬蛋白酶3、7、9，參與周期性的內(nèi)膜基質(zhì)分解及脫落調(diào)節(jié)過程。但在胚胎著床期的子宮內(nèi)膜，Lefty基因卻無表達;同樣的研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌癥所致不孕患者的內(nèi)膜中，Lefty蛋白的不成熟形式，即分子量為44kDa多肽大量表達。在小鼠的整個月經(jīng)周期及妊娠1-3天內(nèi)，Leftym RNA及蛋白均有表達，妊娠第9天消失;但Lefty基因轉(zhuǎn)染內(nèi)膜后，小鼠胚

4、胎著床率明顯減少。Lefty在子宮內(nèi)膜中這種特殊的表達方式，提示其與子宮內(nèi)膜蛻膜化有關(guān)。但是在人類子宮蛻膜中，隨著妊娠的建立及維持，Lefty是否表達及變化趨勢，目前尚未見報道。因此，我們擬通過PCR、Western blotting等生物化學方法，檢測Lefty在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)子宮蛻膜組織中的表達，證明Lefty在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織中表達增加，參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜化受損過程。
　　子宮蛻膜化反應(yīng)最明顯的特征是內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、分

5、化成多倍體蛻膜細胞，細胞形態(tài)表現(xiàn)為大的單核或雙核細胞，DNA增加4倍、8倍、或者更多倍，表明細胞經(jīng)過了核內(nèi)復(fù)制而不是細胞分裂。核內(nèi)復(fù)制的特點提示我們在間質(zhì)細胞蛻膜化過程中，細胞周期的改變導(dǎo)致DNA復(fù)制而無細胞分裂。在生殖周期中，子宮受到雌孕激素的調(diào)節(jié)，其中細胞周期調(diào)節(jié)因子也因發(fā)生周期性改變而發(fā)揮作用。在增殖期子宮內(nèi)膜上皮細胞及間質(zhì)細胞，特殊的周期素及周期素依賴鏈激酶表達增加，而在分泌期，P57等細胞周期調(diào)節(jié)因子在孕激素作用下表達增加。關(guān)

6、于Lefty在蛻膜化過程中與細胞周期關(guān)系的研究極少。因此，我們擬通過基因重組、RNA干擾等分子生物學方法，檢測體外間質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)過程中細胞周期因子cyclinD1及P57的表達，證明Lefty基因通過調(diào)控細胞周期來抑制間質(zhì)細胞蛻膜化。
　　方法：
　　一、Lefty在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、正常早期妊娠子宮蛻膜中的表達
　　1、PCR方法檢測早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、正常早期妊娠的子宮蛻膜中Lefty mRNA的表達水平。
　

7、　2、免疫組織化學法、Western Blotting法檢測早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、正常早期妊娠的子宮蛻膜中Lefty蛋白表達。
　　二、Lefty基因在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(hESC)蛻膜化過程中的表達及作用
　　1、原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(hESC)并進行傳代。
　　2、免疫細胞化學染色鑒定hESC細胞。
　　3、hESC體外蛻膜化誘導(dǎo)及蛻膜化標志物PRL、IGFBP-1檢測。
　　4、構(gòu)建pc-DNA3.1(

8、+)Lefty過表達載體，酶切鑒定及測序，瞬時轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)48h的hESC。
　　5、靶向hESC中Lefty基因的SiRNA干擾及篩選，瞬時轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)48h的hESC。
　　6、熒光定量PCR、Western Blotting檢測Lefty mRNA及蛋白表達，驗證pcDNA3.1(+)-Lefty、SiRNA轉(zhuǎn)染效率。
　　7、Western Blotting檢測各組hESCs中P57、cyclinD1表達水平。

9、　　8、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組hESCs上清液中PRL、IGFBP-1的含量。
　　9、流式細胞儀檢測Lefty基因?qū)毎芷诘挠绊憽?br>　　結(jié)果：
　　一、Lefty在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常早期妊娠子宮蛻膜中的表達
　　1、PCR結(jié)果表明:妊娠早期子宮蛻膜Lefty mRNA相對表達水平為0.64±0.07，明顯低于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組子宮蛻膜1.04±0.12(P＜0.05)。
　　2、免疫組織化學

10、結(jié)果表明:Lefty在子宮蛻膜組織的間質(zhì)細胞漿內(nèi)表達，在妊娠早期子宮蛻膜陽性表達率為20.0％，明顯低于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組85％(P＜0.05)。
　　3、Western blotting結(jié)果表明:在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常早期妊娠子宮蛻膜內(nèi)，Lefty蛋白均以裂解后的分子量為34kDa活性蛋白形式出現(xiàn)。
　　二、Lefty基因在人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(hESC)蛻膜化中的作用
　　1、體外成功分離和培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(hESC

11、)。
　　2、免疫細胞化學染色鑒定結(jié)果表明細胞波形蛋白染色陽性，CD10染色陽性，角蛋白、Ⅷ因子及白細胞共同抗原染色均陰性，證實為人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。
　　3、在MPA和8-Br-cAMP誘導(dǎo)下，hESC逐漸增大、變圓，胞漿透亮，細胞核增大。ELISA結(jié)果表明，培養(yǎng)上清液中的PRL和IGFBP-1在誘導(dǎo)第4天明顯增加，證實體外間質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)成功。
　　4、構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Lefty過表達載體，序列鑒定證

12、實。篩選SiRNA片段，其中Lefty-homo-872使用量50nM沉默效率最高，為86.63％。
　　5、熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果表明:hESC轉(zhuǎn)染Lefty過表達載體后，Lefty mRNA及蛋白明顯增加;hESC轉(zhuǎn)染SiRNA后，Lefty mRNA及蛋白明顯降低。hESC蛻膜化誘導(dǎo)后，Lefty未成熟蛋白減少，成熟蛋白增加。
　　6、ELISA結(jié)果表明:hESCs轉(zhuǎn)染Lefty過表達載體

13、后誘導(dǎo)，PRL、IGFBP-1分泌量明顯降低;hESCs轉(zhuǎn)染Lefty siRNA后誘導(dǎo)，PRL、IGFBP-1分泌量明顯增加。
　　7、流式細胞儀檢測結(jié)果表明:hESCs蛻膜化誘導(dǎo)后，S期細胞比例明顯減少，G0/1期細胞比例明顯增加，發(fā)生G0/1至S期阻滯。hESCs轉(zhuǎn)染Lefty過表達載體后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的G0/1至S期阻滯。
　　8、Western blotting結(jié)果表明:hESCs蛻膜化誘導(dǎo)后，P57蛋白增

14、加，Cyclin D1蛋白下降;轉(zhuǎn)染Lefty過表達載體后誘導(dǎo)，P57、Cyclin D1蛋白無明顯變化，轉(zhuǎn)染Lefty SiRNA后誘導(dǎo)，P57蛋白明顯上調(diào)，CyclinD1蛋白明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1、Lefty基因及蛋白在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織內(nèi)表達增加，可能通過抑制子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)，參與早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病過程。
　　2、Lefty基因通過調(diào)控cyclinD1及P57的表達來調(diào)節(jié)、控制細胞周期、從而抑制