TRAIL在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程中的功能研究.pdf

1、胚胎著床是胎生哺乳動(dòng)物及人類生殖的重要環(huán)節(jié)，胚胎著床的關(guān)鍵步驟是胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的侵入。滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的“對(duì)話”精確地調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖分化和子宮內(nèi)膜的蛻膜化。蛻膜是子宮內(nèi)膜基質(zhì)受蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激而增殖和再分化形成的一種特殊組織，它對(duì)妊娠的建立和維持至關(guān)重要。在小鼠，胚胎粘附誘導(dǎo)上皮下基質(zhì)細(xì)胞增殖、分化為成熟的蛻膜細(xì)胞，并逐漸向周圍擴(kuò)展，形成的蛻膜細(xì)胞又依照同樣的方向不斷退化和死亡，并被鄰近的滋

2、養(yǎng)層細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬。蛻膜細(xì)胞的增殖和退化同時(shí)并存，二者在動(dòng)態(tài)平衡中協(xié)調(diào)蛻膜細(xì)胞的數(shù)量和滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入。現(xiàn)己表明，蛻膜細(xì)胞的增殖與退化是一個(gè)涉及多種因素的細(xì)胞凋亡過(guò)程。鑒于該過(guò)程與腫瘤侵襲過(guò)程的相似性，其涉及的調(diào)控機(jī)制也是目前生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 在諸多參與細(xì)胞凋亡的因子中，腫瘤壞死因子TNF是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類重要的細(xì)胞因子，TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）作為

3、其家族成員是近幾年腫瘤預(yù)防和治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)室在前期的小鼠子宮免疫組化時(shí)發(fā)現(xiàn)，TRAIL在植入前的子宮上皮及植入后蛻膜細(xì)胞的表達(dá)呈現(xiàn)出很強(qiáng)的時(shí)空特異性，并且此期間TRAIL特異的凋亡受體MK（Mouse Killer），的表達(dá)也呈相互配合的趨勢(shì)，這提示TRAIL信號(hào)可能與小鼠植入后蛻膜細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系，可能參與了妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的進(jìn)程。
　　 基于前期試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)采用基因工程技術(shù)、細(xì)胞原代培養(yǎng)、Wes

4、tern blotting、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR以及宮角注射等方法初步探討TRAIL對(duì)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的作用及其分子機(jī)理。該研究將為闡明胚胎著床的分子機(jī)理補(bǔ)充新的證據(jù)，同時(shí)也為胚胎植入與腫瘤侵襲的比較研究提供新的視野。
　　 第一部分、 TRAIL在小鼠子宮蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：篩選分離提取小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的最佳方法，了解原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，分析基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)

5、蛻膜化之后TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　 方法：胰酶消化法和混合酶消化法分離提取并培養(yǎng)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞貼壁率找出基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)所需的最適pH，采用MTT試驗(yàn)繪制生長(zhǎng)曲線，找到其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最后用孕酮、雌二醇和cAMP誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，RT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)。

6、　　 結(jié)果：1.相對(duì)于混合酶消化法，胰酶消化法成本低，省時(shí)省力，且提取培養(yǎng)的原代妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多，純度較高，達(dá)到（95.8±0.3）％；2.基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH值為7.0，原代培養(yǎng)12-48h為其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48h后即進(jìn)入平臺(tái)期；3.小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)蛻膜化后，TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)隨時(shí)間增長(zhǎng)而顯著升高（p<0.05）。
　　 結(jié)論：成功篩選出高效可行、簡(jiǎn)單實(shí)用的基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，并初步了解基

7、質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，同時(shí)對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)TRAIL在蛻膜化過(guò)程中有特異的表達(dá)變化。
　　 第二部分、卵巢激素對(duì)小鼠子宮中TRAIL基因表達(dá)的調(diào)控
　　 目的：探討孕酮、雌二醇是否對(duì)TRAIL基因在小鼠子宮的表達(dá)具有調(diào)控作用。
　　 方法：將去卵巢小鼠隨機(jī)分為4組，每組3只：1.孕酮組，0.2mg/mouse；2.雌二醇組，100ng/mouse；3.孕酮+雌二醇組，劑量同前；4.對(duì)照組，芝麻油0.1

8、ml/mouse。分別于皮下注射后0h、6h、12h、24h取各組小鼠子宮，采用熒光定量PCR對(duì)TRAIL mRNA的水平進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用Western blotting檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：孕酮和雌二醇均能顯著提高TRAIL mRNA和蛋白在小鼠子宮中的表達(dá)，且表現(xiàn)為時(shí)間依賴性，隨時(shí)間增長(zhǎng)TRAIL mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加（p<0.05），孕酮和雌二醇聯(lián)合使用時(shí)，調(diào)控作用有一定的疊加效應(yīng)（p<0.05）

9、。
　　 結(jié)論：TRAIL基因在小鼠子宮中的表達(dá)受到孕酮、雌二醇的正向調(diào)節(jié)。
　　 第三部分、 TRAIL對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的功能研究
　　 第一節(jié) TRAIL過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建TRAIL過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，為研究TRAIL基因的功能提供工具。
　　 方法：通過(guò)設(shè)計(jì)兩條分別帶有SalⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)的PCR引物，將TRAIL的全長(zhǎng)cDNA序列作為目的序列克隆入pSEB-HUS載體

10、，即pSEB-HUS-TRAIL。通過(guò)菌液PCR檢測(cè)、Sα/Ⅰ和MluⅠ雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。菌液Western blotting檢測(cè)pSEB-HUS-TRAIL在菌液中是否表達(dá)TRAIL蛋白。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建TRAIL基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pSEB-HUS-TRAIL。
　　 第二節(jié) TRAIL干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建、篩選針對(duì)TRAIL基因的干擾質(zhì)粒，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　

11、方法：設(shè)計(jì)、合成4條靶向TRAIL基因的干擾序列，將干擾序列克隆到SfiⅠ酶切后的pSEB-HUS-TRAIL質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化DH5α后進(jìn)行菌液PCR和質(zhì)粒測(cè)序，分別命名為SipSEB-TRAIL1、 SipSEB-TRAIL2、SipSEB-TRAIL3、SipSEB-TRAIL4。將4個(gè)干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，選擇72h后GFP熒光最弱的干擾質(zhì)粒用PacⅠ酶切除去TRAIL基因后自連，即為篩選出的TRAIL干擾質(zhì)粒。

12、　　 結(jié)果：成功構(gòu)建、篩選出SipSEB-TRAIL3為TRAIL基因干擾質(zhì)粒。
　　 第三節(jié) TRAIL對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的影響
　　 目的：觀察過(guò)表達(dá)及干擾TRAIL對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及蛻膜化進(jìn)程的影響，以及對(duì)在體蛻膜化進(jìn)程的影響。
　　 方法：TRAIL過(guò)表達(dá)或干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠基質(zhì)細(xì)胞后誘導(dǎo)蛻膜化發(fā)生，于轉(zhuǎn)染后72h時(shí)，通過(guò)RT-PCR及Western blotting評(píng)

13、價(jià)其轉(zhuǎn)染TRAIL過(guò)表達(dá)及干擾質(zhì)粒后增強(qiáng)或抑制TRAIL表達(dá)的效應(yīng)。通過(guò)MTT法觀察蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡率，Western blotting檢測(cè)催乳素蛋白表達(dá)的變化情況。過(guò)表達(dá)和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后收集逆轉(zhuǎn)錄病毒并測(cè)定滴度。通過(guò)宮角注射分別給予妊娠d3.5小鼠TRAIL過(guò)表達(dá)和干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒，d7和d8時(shí)取蛻膜組織進(jìn)行稱重，同時(shí)統(tǒng)計(jì)植入點(diǎn)數(shù)目。
　　 結(jié)果：TRAIL過(guò)

14、表達(dá)質(zhì)粒能夠上調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)，干擾質(zhì)粒能有效地抑制TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)（p<0.05）。在體外，TRAIL過(guò)表達(dá)使蛻膜基質(zhì)細(xì)胞被阻滯在G0/G1期、抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖并促使其凋亡，催乳素表達(dá)降低，而干擾TRAIL促進(jìn)蛻膜細(xì)胞的增殖，減少了蛻膜細(xì)胞的凋亡，催乳素表達(dá)升高。體內(nèi)宮角注射逆轉(zhuǎn)錄病毒，過(guò)表達(dá)TRAIL使蛻膜組織重量降低，干擾TRAIL使蛻膜組織重量增加，過(guò)表達(dá)和干擾TRAIL后小鼠

15、子宮植入位點(diǎn)均顯著減少。
　　 結(jié)論：過(guò)表達(dá)TRAIL抑制妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進(jìn)程，干擾TRAIL促進(jìn)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進(jìn)程，但二者均造成植入胚胎數(shù)量的下降，其原因可能是破壞了子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡的平衡。
　　 第四節(jié) TRAIL影響小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的分子機(jī)理
　　 目的：初步探討TRAIL影響妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的分子機(jī)理。
　　 方法：RT-PCR檢測(cè)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基

16、質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化后，TRAIL受體DcR1、DcR2和MK的mRNA表達(dá)。基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRAIL過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后誘導(dǎo)其蛻膜化，Western blotting檢測(cè)pro-caspase-8及Bcl-2的蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：DcR1 mRNA在誘導(dǎo)基質(zhì)蛻膜化72h升高顯著（p<0.05），DcR2mRNA隨時(shí)間變化不顯著（p>0.05），MK mRNA的表達(dá)隨誘導(dǎo)蛻膜化時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著升高，且表達(dá)量在24h時(shí)達(dá)到高峰（p<0.0

17、5）?；|(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRAIL過(guò)表達(dá)質(zhì)粒72h后的pro-caspase-8及Bcl-2蛋白水平顯著降低（p<0.05）。
　　 結(jié)論：蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中TRAIL過(guò)表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞凋亡水平提高，相反，干擾TRAIL表達(dá)使細(xì)胞凋亡水平降低，推測(cè)小鼠子宮蛻膜細(xì)胞中TRAIL主要通過(guò)與膜受體MK結(jié)合引起pro-caspase-8活化為caspase-8，同時(shí)下調(diào)Bcl-2表達(dá)而通過(guò)線粒體依賴途徑誘導(dǎo)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
　　 綜上所