小鼠子宮內膜mRNAs和miRNAs時空表達與胚胎著床的關系及SPOP對基質細胞蛻膜化的影響.pdf

1、第一部分:小鼠子宮內膜mRNAs和miRNAs的時空表達與胚胎著床的相關性研究
　　目的：胚胎圍著床是一個動態(tài)的生理過程，這一過程被分成三個階段，分別是容受前期、容受期和胚胎著床期。整個胚胎圍著床過程子宮內膜形態(tài)和分子發(fā)生顯著改變。子宮內膜在不同時間，不同部位基因差異表達是引起細胞組織形態(tài)和分子變化的原因，同時這也確保了胚胎成功的著床。microRNA（miRNA）是重要的調節(jié)分子，miRNA主要在細胞、組織的增殖、分化、凋亡等生

2、理過程中發(fā)揮作用。而在胚胎著床過程中miRNA同樣發(fā)揮重要的調節(jié)作用，miRNAs的對基因的調節(jié)作用決定了基因差異表達的形成。動態(tài)分析胚胎著床過程中mRNA譜和microRNA譜的變化特征，可以為全面理解和闡釋胚胎動態(tài)著床過程中的機制提供堅實的實驗支持。
　　方法：分別收集容受前期、容受期和胚胎著床期子宮內膜組織，對應于小鼠孕第一天（d1）、孕第四天（d4）和孕第五天著床點(d5IS)和孕第五天著床旁(d5IIS)的昆明小鼠子宮內

3、膜組織。采用Trizol法提取樣本總RNA。采用深度測序技術檢測小鼠子宮內膜不同時期（d1、d4和d5）或不同部位（d5IS和d5IIS）的mRNA和microRNA的表達情況。采用RT-PCR檢測隨機選擇的miRNA和mRNA表達水平是否與NGS檢測的結果一致。通過NGS測序獲得小鼠孕d1、d4、d5IS和d5IIS的mRNA表達譜，并將四組數據進行兩兩成對比較，篩選出顯著性差異表達基因，采用維恩圖對小鼠圍著床期基因表達進行動態(tài)分析。

4、通過NGS測序獲得小鼠d1、d4、d5IS和d5IIS的miRNA表達譜，通過兩兩成對比較獲得顯著性差異的miRNAs，再利用Targetscan database、miRanda database和DIANA-microT3.0三種軟件預測miRNA的靶向基因，最后預測結果采取交集定為最終的靶基因。利用mRNA譜確定靶基因的表達量，同時結合miRNA表達量篩選出miRNA與對應靶向基因是否具有負向調節(jié)的關系。
　　結果：NGS檢

5、測的miRNAs結果表明d1、d4、d5IS和d5IIS的miRNAs表達具有顯著差異，其中d1和d5IS組織中以上調miRNAs表達為主；而d4組織中以下調的miRNAs表達為主。提示在圍著床期miRNAs具有不同的作用。對顯著差異表達的63個miRNAs進行靶基因預測，獲得5720個靶基因。結合miRNAs譜和mRNAs譜的表達水平，在d1、d4、d5三個時間點共篩選出1473對miRNA-mRNA呈現負相關性表達，而在d1、d4、

6、d5三個時間點miRNA-mRNA表達量都始終保持負相關的有138對。在負相關表達的miRNA-mRNA對中隨機選取5對miRNA-mRNAs利用實時熒光定量PCR進行檢測miRNA-mRNAs各自的表達量，驗證了NGS檢測的miRNA和mRNA數據譜可靠性，同時證明了在圍著床期miRNA-mRNA存在負相關性，表明miRNA對mRNA具有調控作用。根據miRNA-mRNA相互作用網絡圖分析，表明了miRNAs對mRNAs的調節(jié)作用。同

7、時揭示了與容受態(tài)功能相關的Bcl-2,Klf13和PGR基因是網絡圖中核心miRNA:mmu-miR-106a-5p,mmu-miR-200b-3p,mmu-miR-96-5p的靶基因。
　　結論：NGS檢測的mRNAs結果表明孕d1、d4、d5IS和d5IIS的mRNA表達具有顯著時空差異性，這種表達差異決定了圍著床期子宮內膜在不同時期和部位發(fā)揮不同作用。在胚胎著床時miRNAs對mRNAs表達存在調控作用。而這種調節(jié)方式在圍著

8、床期的整個過程持續(xù)發(fā)揮作用。多個與與容受態(tài)相關的Bcl-2, Klf13和PGR基因是核心miRNA的靶基因表明miRNAs在小鼠子宮內膜容受狀態(tài)的形成和維持早期妊娠中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分:SPOP對子宮內膜基質細胞蛻膜化的影響
　　目的：子宮內膜基質細胞蛻膜分化是成功實現胚胎著床的重要過程，受雌孕激素調節(jié)的子宮內膜基質細胞在這一過程發(fā)生明顯的增殖、分化。我們前期研究證明，SPOP在胚胎著床第5天的著床點和著床旁組織

9、中表達存在顯著差異，而SPOP與泛素化作用密切相關。關于泛素化與胚胎著床的相關研究尚未見報道。因此，本課題著眼于小鼠圍著床期SPOP研究，揭示SPOP在胚胎著床過程中發(fā)揮的作用。
　　方法：建立昆明小鼠早孕模型、小鼠假孕模型、人工激素調控的小鼠模型。采用定量RT-PCR、Western blot和免疫組織化學技術檢測SPOP mRNA或蛋白在各種模型小鼠（早孕小鼠，假孕小鼠和激素調控）子宮內膜中表達規(guī)律。采用siRNA構建人工誘導

10、蛻膜細胞SPOP敲除模型。siRNA敲除SPOP后，檢測蛻膜化細胞蛻膜標志物的表達情況。利用流式細胞技術檢測SPOP對凋亡作用的影響。
　　結果：SPOP在圍著床期呈波動表達d1、d2和d3表達較低，從d4到d6表達顯著增加，d7表達出現回落。假孕小鼠模型中SPOP具有同樣波動表達的模式。人工誘導蛻膜化后小鼠子宮內膜SPOP表達顯著增加。利用激素調控小鼠模型證實SPOP的表達受雌激素和孕激素的調控。siRNA敲除SPOP后基質蛻膜