葉柄缺乏對子宮內膜受性相關基因表達的甲基化調控及其對胚胎著床的影響.pdf

1、第一部分:葉酸缺乏對子宮內膜容受性相關基因表達的甲基化調控及其對胚胎著床的影響
　　目的：葉酸是哺乳類動物生長發(fā)育過程中擔負一碳單位傳遞的B族維生素，是機體各種甲基化反應的甲基供體。葉酸攝入不足或葉酸代謝障礙時，可引起基因組DNA固有甲基化模式的改變而促進基因表達或抑制基因表達，誘發(fā)疾病狀態(tài)，通過表觀遺傳修飾這一途徑參與多種生命活動過程中的基因表達調控。但迄今為止，對于在妊娠早期子宮內膜容受性建立過程中，低葉酸水平是否會通過表觀遺

2、傳修飾(DNA甲基化)來調控子宮內膜容受性相關基因的表達，進而影響胚胎著床，目前未見任何相關報道。因此，本研究旨在探索孕期低葉酸水平是否會影響子宮內膜容受性相關基因(Cdh1、Pgr、Esrl)DNA甲基化模式及其基因表達的改變，從而對胚胎著床產生影響。
　　方法：建立葉酸缺乏孕鼠和正常孕鼠胚胎著床模型。采用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鈉測序方法對Cdhl、Pgr、Esrl基因啟動子區(qū)的甲基化模式進行分析。采用Real-time

3、PCR、Western-blot、免疫組化對Cdhl、Pgr、Esrl基因的mRNA和蛋白表達進行分析。采用掃描電鏡方法對子宮內膜容受性建立的形態(tài)學標志物-胞飲突的形態(tài)和數(shù)量進行檢測。孕鼠尾靜脈注射臺盼藍后計數(shù)孕鼠妊娠第5天的胚胎著床點數(shù)量。
　　結果：甲基化分析結果顯示葉酸缺乏情況下Esrl基因啟動子區(qū)的甲基化率顯著降低，而Cdhl、Pgr基因啟動子的甲基化率沒有發(fā)生顯著改變?；虮磉_分析結果顯示葉酸缺乏孕鼠組Esrl基因表達顯

4、著降低，而Cdhl、Pgr基因表達略高于正常對照組，但不具有統(tǒng)計學意義。掃描電鏡結果顯示葉酸缺乏情況下胞飲突的數(shù)量和形態(tài)均未發(fā)生明顯改變。與正常對照組相比較，葉酸缺乏孕鼠組的妊娠率和妊娠第5天孕鼠的胚胎著床點數(shù)量均沒有發(fā)生顯著改變，胚胎正常著床。
　　結論：在子宮內膜容受性建立這一正常生理過程中，DNA甲基化對容受性相關基因Cdhl、Pgr的表達調控作用并不明顯，而Esrl的表達可能會受到DNA甲基化調控，但并不影響胚胎正常著床。

5、葉酸缺乏下胚胎能夠正常著床提示葉酸缺乏導致胚胎發(fā)育異?？赡苁侵惨院蟮呐咛グl(fā)育發(fā)生了異常。甲基化調控在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中與子宮內膜容受性建立這一正常生理過程中的不同作用，可能會為闡明腫瘤侵襲的“無控性”和胚胎著床的“有控性”機制提供新的線索。
　　第二部分:葉酸缺乏對著床后子宮內膜蛻膜化的影響
　　目的：胚胎著床以后子宮內膜蛻膜功能的正常表達是胎盤形成的重要基礎，并在胎盤形成以前擔負著保護和營養(yǎng)胚胎的重要作用，對妊娠的建立和

6、維持至關重要。研究發(fā)現(xiàn)葉酸對胎盤的發(fā)育起著重要作用。但葉酸對著床后子宮內膜蛻膜化進程的影響以及葉酸缺乏是否會引起子宮內膜蛻膜化發(fā)生改變，從而造成胚胎發(fā)育異常，目前并不清楚，這值得我們去探索。因此，本研究旨在探索著床后子宮內膜蛻膜化是否會受到孕期低葉酸水平的影響。
　　方法：建立葉酸缺乏孕鼠和正常孕鼠胚胎著床模型，對孕鼠胎兒的出生情況進行統(tǒng)計。采用HE方法檢測孕鼠妊娠d7子宮內膜形態(tài)。采用Real-time PCR、Western-

7、blot、免疫組化對孕鼠妊娠d7、d8子宮內膜Hoxa10、MMP2基因表達進行分析。采用流式細胞術檢測妊娠d7子宮內膜的凋亡情況，并采用Western-blot對凋亡相關因子Bax、Bcl2的表達進行了分析。
　　結果：葉酸缺乏孕鼠組胎兒出生率為(0，0/20)顯著低于正常對照組(90％，18/20)。觀察妊娠d7孕鼠子宮，葉酸缺乏孕鼠組(50％，4/8)胚胎呈現(xiàn)不同程度的吸收和發(fā)育阻滯現(xiàn)象，明顯高于正常對照組(12.5％，1/

8、8)。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)妊娠d7葉酸缺乏孕鼠組子宮內膜蛻膜形態(tài)發(fā)生改變。進一步檢測發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏情況下，在蛻膜化過程中起著重要作用的Hoxa10和MMP2基因表達顯著降低。凋亡的正常維持對蛻膜化具有重要意義。檢測發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏孕鼠組妊娠d7子宮內膜的凋亡率明顯低于正常對照組，且葉酸缺乏孕鼠組促凋亡因子Bax蛋白表達明顯低于正常組，而抑凋亡因子Bcl2的表達卻顯著高于正常組。
　　結論：研究發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏情況下，在子宮內膜的蛻膜化中起著重要