Tiam1在早孕小鼠子宮內(nèi)膜的表達及功能研究.pdf

1、生殖現(xiàn)象是生物界最普遍和最根本的特征之一，胚胎著床是人類和哺乳動物生殖過程中妊娠建立的第一步，也是決定妊娠成功與否的關(guān)鍵。成功的植入取決于的子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)的建立和具有侵入性的胚泡的生長的同步化。子宮內(nèi)膜僅在某一特定時期允許胚胎著床，這一時期時間很短，代表著子宮內(nèi)膜對胚胎具有容受性，稱為“著床窗口期”。胚胎著床過程包括胚泡的定位、識別、結(jié)合、黏附、侵入并被包埋到子宮內(nèi)膜幾個階段。該過程涉及到眾多基因的調(diào)控以及錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子的參與，早

2、期的胚胎發(fā)育和著床的詳細(xì)分子機制尚未完全清楚。自1829年提出腫瘤胚胎性起源概念以來，胚泡著床與腫瘤侵襲性轉(zhuǎn)移之間相似的生物學(xué)行為就越來越受到重視，原癌基因及腫瘤抑制基因也成為了胚泡著床機制研究的熱點。Tiaml（T-Iymphoma invasion and metastasis inducing protein1，T淋巴細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白1）參與腫瘤發(fā)生的多個過程，比如：腫瘤細(xì)胞遷移、黏附、侵襲，基質(zhì)蛋白水解，細(xì)胞骨架的再塑形、細(xì)

3、胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等，而這些過程對胚泡著床也是至關(guān)重要的。本研究旨在檢測Tiaml在早孕小鼠子宮內(nèi)膜中的表達規(guī)律，探討Tiaml對小鼠胚胎著床的影響。我們用FQ-PCR和免疫組織化學(xué)的方法和Western Blot試驗分別檢測未孕小鼠及早孕2、3、4、5、6、7天子宮內(nèi)膜Tiaml基因和蛋白的表達規(guī)律。小鼠子宮角于孕4天早晨注射Tiaml抗體后，在孕9天觀察胚泡著床數(shù)及其對著床的影響。FQ-PCR結(jié)果顯示妊娠小鼠子宮內(nèi)膜組織T

4、iaml mRNA的表達明顯高于未妊娠小鼠，且隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢，在妊娠第五天達到最高峰（mean±SD，p<0.05）。免疫組化分析顯示Tiaml蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律與FQ-PCR結(jié)果一致。Western Blot實驗結(jié)果顯示Tiaml蛋白表達的整體趨勢是隨著孕日的推移表達量逐漸增高，孕5天達到最高峰，從孕6天和孕7天開始逐漸降低。子宮角注射Tiaml多克隆抗體后與正常對照組比較，胚泡著床數(shù)明顯減少（mean

5、±SD，p<0.05）。因此，我們推測Tiaml可能對小鼠胚泡著床起著重要的調(diào)控作用。 目的：研究原癌基因Tiaml在小鼠子宮內(nèi)膜表達的規(guī)律性變化及其對胚泡植入的影響，初步探討它在小鼠胚胎著床過程中的作用。 方法： 1.收集未孕和早孕2、3、4、5、6、7天小鼠子宮內(nèi)膜，共7組進行Tiaml表達規(guī)律的實驗，每個實驗中均為7個組，每組小鼠的樣本量為20只。 （1）運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）

6、技術(shù)測定TiamlmRNA的表達規(guī)律； （2）免疫組織化學(xué)SP法檢測未孕和早孕小鼠子宮內(nèi)膜中Tiaml蛋白的表達情況，并進行定位分析； （3）運用Western Blot試驗對未孕和早孕小鼠子宮內(nèi)膜中Tiaml蛋白的表達進行定量的分析； 2.孕鼠80只進行Tiaml1功能研究。于孕4天上午8AM-9AM小鼠子宮角分別注射抗Tiaml抗體和生理鹽水，于孕9天觀察著床胚泡數(shù)并與正常對照組進行對比，分析Tiaml蛋白對

7、胚泡植入的影響。 結(jié)果： 1.FQ-PCR：未孕和早孕小鼠的子宮內(nèi)膜均有Tiaml mRNA表達，早孕小鼠子宮內(nèi)膜組織TiamlmRNA的表達高于未孕小鼠子宮內(nèi)膜組織，且隨著妊娠天數(shù)的增加呈現(xiàn)表達逐漸增強的趨勢，到妊娠第5天達到最高； 2.免疫組織化學(xué)：Tiaml蛋白在早孕小鼠子宮內(nèi)膜廣泛表達，隨著孕日的推移，其表達部位也呈現(xiàn)不同的變化，在孕3-5天主要存在于腔上皮，孕4天至孕6天主要存在于腺上皮，而在基質(zhì)細(xì)胞的

8、表達呈現(xiàn)出隨孕日增加逐漸增加，且在孕5天（著床窗口期）達到最高。 3.Western Blot：Tiaml蛋白表達的整體趨勢是隨著孕日的增加表達量逐漸增高，孕5天達到最高峰，從孕6天、孕7開始逐漸降低。 4.于著床前的孕4天8AM-9AM子宮角注射抗Tiaml抗體，于孕9天觀察胚泡著床數(shù)，結(jié)果顯示注射抗Tiaml抗體后胚泡著床數(shù)明顯減少，差異顯著（p<0.05）。 結(jié)論： Tiaml mRNA和蛋白在孕

9、1-5天逐漸增加并在著床窗口期達到最高峰，且Tiaml蛋白在孕2、3天即著床前在腔上皮明顯增加，我們推測Tiaml可能通過重組肌動蛋白骨架、形成和維持緊密連接及增加以E-鈣粘素為基礎(chǔ)的黏附連接來調(diào)控著胚泡的移動、定位和黏附。Tiaml蛋白圍繞著床窗在腺上皮細(xì)胞的高表達可能與胚泡植入時調(diào)控腺體的分泌有關(guān)。Tiaml蛋白表達在孕四天的基質(zhì)細(xì)胞顯著增高、在孕五天即著床窗達到最高峰且在孕六天仍保持著高的水平，這些結(jié)果可能建議Tiaml可能在胚泡