人蛻膜組織子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究認(rèn)為，人子宮內(nèi)膜功能層和基底層中存在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stemcells，EnSCs)，EnSCs與子宮內(nèi)膜的生理性再生及子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜息肉等疾病有明顯的相關(guān)性，另外EnSCs在子宮內(nèi)膜再生、盆腔臟器脫垂、膀胱尿道組織修復(fù)等已有廣泛的研究。當(dāng)前國內(nèi)外主要從正常子宮內(nèi)膜中獲取EnSCs，而由于刮宮、炎癥等引起的子宮內(nèi)膜重度損傷患者，EnSCs的獲取將成為困難。研究認(rèn)為宮腔粘連的發(fā)生主要由子宮內(nèi)膜基底層中

2、EnSCs的不足或功能異常引起，所以我們嘗試從蛻膜中提取EnSCs并儲存，該方法具有操作方便并且不受倫理限制等優(yōu)點(diǎn)，可為日后的相關(guān)疾病中組織修復(fù)的應(yīng)用提供可靠的細(xì)胞基礎(chǔ)。本研究從蛻膜組織中分離、純化、擴(kuò)增、培養(yǎng)EnSCs，并對EnSCs進(jìn)行干細(xì)胞特性鑒定，通過體外誘導(dǎo)觀察EnSCs的多向分化的潛能，為EnSCs在子宮內(nèi)膜損傷、盆腔臟器脫垂、陰道重建等組織修復(fù)應(yīng)用和子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜癌等子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病提供可行的細(xì)胞模

3、型。
　　目的:
　　1、研究人蛻膜組織中子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)方法，并對所分離的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。
　　2、研究人蛻膜組織中子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性，通過體外誘導(dǎo)的方法研究人蛻膜組織子宮內(nèi)膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分化能力。
　　方法:
　　1、取行人工流產(chǎn)患者的蛻膜組織，用胰酶和膠原酶消化蛻膜組織，分離子宮內(nèi)膜細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，以極低密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，分離單克

4、隆貼壁生長的細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜干細(xì)胞形態(tài)變化及克隆形成情況。
　　2、采用CCK-8法繪制子宮內(nèi)膜干細(xì)胞生長曲線，并計(jì)算倍增時(shí)間。
　　3、流式細(xì)胞儀分析子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146表達(dá)情況。
　　4、通過成骨誘導(dǎo)液和平滑肌誘導(dǎo)液研究子宮內(nèi)膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和平滑肌分化的潛能。
　　5、通過堿性磷酸酶染

5、色、茜素紅染色對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定;免疫熒光和蛋白印跡對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:
　　1、子宮內(nèi)膜干細(xì)胞呈長梭形，成纖維細(xì)胞樣，可見粗細(xì)不等的胞質(zhì)突起，增殖至80-90％呈漩渦狀生長，其克隆形成率分別為3.91％和9.14％;
　　2、EnSCs生長曲線呈“S”型，接種48 h至60 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，于第9天達(dá)到平臺期，倍增時(shí)間為37-52 h。
　　3、

6、流式細(xì)胞儀測定EnSCs細(xì)胞表面抗原CD29(99.13％)，CD44(97.39％)，CD73(99.68％)，CD90(96.76％)，CD105(89.64％)，CD146(77.96％)呈陽性表達(dá)，而CD31(1.30％)，CD34(0.68％)，CD45(1.26％)呈陰性表達(dá)，
　　4、流式細(xì)胞儀分析子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的細(xì)胞周期提示，有61.79％的細(xì)胞處于G0/G1期，22.37％的細(xì)胞處于S+G2/M期。
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