人FⅧ基因的表達(dá)不依賴其5′端CpG島的甲基化.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定的重亞硫酸鹽測(cè)序（Bisulfite-sequencing PCR,BSP）檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)人類永生化肝細(xì)胞LO2中凝血因子Ⅷ（Coagulation factorⅧ,FⅧ）基因5′端CpG島的甲基化水平，對(duì)比檢測(cè)正常人新鮮肝組織及L-Arg刺激的LO2細(xì)胞FⅧ甲基化CpG島的狀態(tài)，探究甲基化的CpG島對(duì)FⅧ表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法：Methprimer軟件預(yù)測(cè)FⅧ基因啟動(dòng)子上游的CpG島，將第一個(gè)CpG島劃分為三個(gè)

2、獨(dú)立片段：CpG is1-1、CpG is1-2及CpG is1-3；第二個(gè)CpG島為一個(gè)完整片段：CpG is2。并設(shè)計(jì)BSP引物。運(yùn)用BSP聯(lián)合TA克隆、藍(lán)白斑篩選及質(zhì)粒PCR，驗(yàn)證十個(gè)陽(yáng)性單克隆并送測(cè)序，BiQ Analyzer軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行甲基化位點(diǎn)分析，以（甲基化CG位點(diǎn)個(gè)數(shù)）/（甲基化CG位點(diǎn)個(gè)數(shù)+非甲基化位點(diǎn)個(gè)數(shù)）計(jì)算各個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率。RT-PCR檢測(cè)LO2細(xì)胞、正常人肝組織及L-Arg刺激的LO2細(xì)胞FⅧ的轉(zhuǎn)

3、錄水平，BSP檢測(cè)正常人肝細(xì)胞及L-Arg刺激的LO2細(xì)胞CpG is2的甲基化狀態(tài)，SPSS軟件分析三者之間CpG is2的單個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率的差異。
　　結(jié)果：人FⅧ基因5′端存在兩個(gè)CpG島：CpG island1位于-4879─-4071，全長(zhǎng)809bp；CpG island2位于-3600─-3323，全長(zhǎng)278bp。LO2細(xì)胞中，CpG is1-1共12個(gè)CpG位點(diǎn)，整體甲基化率為0％；CpG is1-2共40個(gè)C

4、pG位點(diǎn)，整體甲基化率為0-20%；CpG is1-3共27個(gè)CpG位點(diǎn)，整體甲基化率為0-20%；CpG is2共23個(gè)CpG位點(diǎn)，整體甲基化率為80-100%。RT-PCR結(jié)果顯示：LO2細(xì)胞不轉(zhuǎn)錄FⅧ；正常人肝細(xì)胞及L-Arg刺激LO2細(xì)胞36小時(shí)后能檢測(cè)到FⅧ的轉(zhuǎn)錄。對(duì)比檢測(cè)CpG is2甲基化水平，正常人肝組織為70%-100%，L-Arg刺激LO2細(xì)胞為60%-100%。LO2細(xì)胞、正常人肝組織及L-Arg刺激的LO2細(xì)胞C