金屬硫蛋白-3在食管癌中的表達及其CpG島超甲基化研究.pdf

1、目的：食管癌是人類常見的惡性腫瘤。中國男、女平均死亡率分別為7.7/10萬和18.8/10萬<'[1]>，嚴重危害著人們的健康。流行病學資料顯示膳食缺乏維生素、亞硝酸鹽含量增高以及食物霉菌污染等可能與食管癌發(fā)生有關(guān)<'[2，3，4]>。隨著分子生物學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)食管癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多個基因的改變，是癌基因的激活與抑癌基因失活長期協(xié)同作用的結(jié)果。因此深入研究食管癌的發(fā)病機制，以有效地對其進行預(yù)防和治療有著非常重要的意義。如同其它惡性腫瘤

2、，食管癌的發(fā)生和發(fā)展包括遺傳機制和后生機制，而甲基化是目前已知的唯一后生機<'[5]>。金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類廣泛分布于生物體體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，在維持金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、重金屬的解毒、清除自由基等方面具有重要作用。至今已發(fā)現(xiàn)MT的四種同分異構(gòu)體，即MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。相對于其他金屬硫蛋白，MT-3具有特異結(jié)構(gòu)和特異生物學功能，是神經(jīng)系統(tǒng)中第一個被鑒定的具有神經(jīng)元生長抑

3、制功能的蛋白質(zhì)<'[6]>。有研究顯示胃癌中MT-3基因存在異常甲基化<'[26]>。本課題應(yīng)用MethvlatedSpecific PCR(MSP)法和Reverse Transcription PCR(RT-PCR)法檢測食管癌細胞株、新鮮食管癌標本及其對應(yīng)正常食管粘膜組織中MT-3基因CpG島的甲基化情況及MT-3的表達情況，旨在研究MT-3基因CpG島超甲基化與食管癌之間的關(guān)系。材料與 方法： 1 選取四種食管癌細

4、胞株：OE33、Eca109、TEl和TEl3，根據(jù)結(jié)果選擇一種食管癌細胞株作為陽性對照；采集胃癌手術(shù)中近側(cè)端正常食管粘膜(均經(jīng)術(shù)后病理證實、)5例做為陰性對照；采集手術(shù)切除的食管癌組織及對應(yīng)的正常食管粘膜組織各20例。 2 分別提取上述細胞株和組織的DNA和RNA，DNA進行亞硫酸氫鈉處理后，應(yīng)用MSP法對MT-3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況進行研究；應(yīng)用RT-PCR法對MT-3 mRNA的表達進行研究，然后與患者臨床病理參

5、數(shù)進行比較。 結(jié)果： 1 四種食管癌細胞株MT-3基因CpG島均存在超甲基化，細胞株0E33發(fā)生甲基化，細胞株Eca109、TEl和TEl3為半甲基化。反轉(zhuǎn)錄PCR顯示：MT-3 mRNA在細胞株OE33中無表達，在細胞株Eca109、TEl和TEl3中均有弱表達。故選擇細胞株OE33做為陽性對照。 2 65％食管癌組織(13/20)和25％正常食管粘膜組織(5/20)存在MT-3基因CpG島超甲基化，而5例

6、正常食管粘膜均未發(fā)生超甲基化(0/5)，提示MT-3基因超甲基化與食管癌發(fā)生之間有統(tǒng)計學意義(X<'2>=6.465，P=0.011)。 3 40％食管癌組織(8/20)和65％正常食管粘膜組織(13/20)存在MT-3基因表達，而5例正常食管粘膜組織均有表達，提示MT-3 mRNA表達與食管癌之間無統(tǒng)計學意義(X<'2>=2.506，P=0.113)。 4 MT-3 mRNA表達率在甲基化腫瘤組織與非甲基化腫瘤組織

7、分別為23.1％和71.4％，甲基化腫瘤組織中MT-3 mRNA表達率低于非甲基化腫瘤組織，二者比較有統(tǒng)計學意義(X<'2>=4.432，P=0.035)；MT-3 mRNA表達率在甲基化正常食管粘膜組織與非甲基化正常食管粘膜組織分別為20％和80％，正常食管粘膜組織中MT-3 mRNA表達率甲基化組低于非甲基化組，二者比較亦有統(tǒng)計學意義(X<'2>=5.934，P=0.015)。 5 根據(jù)術(shù)后病理資料，食管癌組織中呈高/中度組

8、織分化者MT-3基因甲基化率為46.2％(6/13)，低分化者甲基化率為100％(7/7)，二者比較有相關(guān)性(X<'2>=5.799，P=0.016)。分化程度越低，甲基化的比率越高；甲基化與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒和腫瘤的分期均無關(guān)。 結(jié)論： 1 食管癌組織中MT-3基因CpG島甲基化率明顯高正常食管粘膜組織。 2 食管癌組織中MT-3基因CpG島甲基化明顯抑制了該基因的表達。 3 食管癌中MT