Lnc-11的鑒定及其在肝癌中的表達及功能研究.pdf

1、目的:
　　肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜的調(diào)控過程。從一定意義上來說，其發(fā)生是正常細胞內(nèi)的重要調(diào)控基因失常的導(dǎo)致的最終結(jié)果。從分子水平找出肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物，為檢測肝癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后，針對性的進行靶向治療具有重要的臨床應(yīng)用價值。
　　長鏈非編碼RNAs(LncRNAs)一般是指大于200個核苷酸(nucleotide，nt)的非編碼RNA。近年來的研究表明，它們在胚胎發(fā)育和細胞分化中都起著重要作用，具有極其復(fù)雜

2、而重要的生物學(xué)功能。越來越多的研究結(jié)果顯示LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，但相對于編碼基因，非編碼RNA在腫瘤中的研究還處于起步階段。尋找到腫瘤特異的長非編碼RNA，揭示它在腫瘤中的功能對闡明腫瘤的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)潛在的診斷和治療靶點很有意義。
　　方法:
　　本研究分為四個部分:
　　1.驗證Lnc-11在肝癌組織標(biāo)本中表達水平:通過QRT-PCR技術(shù)檢測Lnc-11在肝癌組織與正常肝組織中的表達水平，

3、對前期實驗用芯片檢測出的Lnc-11在腫瘤中的表達水平進行驗證。
　　2.Lnc-11起止序列的鑒定:通過RACE技術(shù)擴增出Lnc-11的5'端和3'端序列，并將RACE產(chǎn)物與pGEM(@)-T Easy載體的連接，EcoR1酶切鑒定陽性克隆，然后進行基因測序鑒定，最后比對數(shù)據(jù)庫中的序列確定Lnc-11的起止系列。
　　3.Lnc-11過表達質(zhì)粒的構(gòu)建:依據(jù)RACE技術(shù)鑒定出Lnc-11的5'端和3'端序列，設(shè)計引物擴增Ln

4、c-11的全長序列，并引入用BamHⅠ和XholⅠ酶切位點，對Lnc-11的PCR產(chǎn)物和pcDNATM3.1(+)和pcDNATM3.1(-)質(zhì)粒雙酶切后分別進行連接，構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-Lnc11和pcDNArM3.1(-)-Lnc11重組質(zhì)粒，測序鑒定。
　　4.Lnc-11對肝癌細胞的遷徙和增殖能力的影響:通過轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒，上調(diào)肝癌細胞中Lnc-11的表達水平，并通過QRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞過表達

5、的效率;進一步通過劃痕修復(fù)、Transwell遷移實驗和增殖實驗，揭示Lnc-11的功能。
　　結(jié)果:
　　1.通過QRT-PCR技術(shù)對43對肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中Lnc-11的表達水平進行檢測，結(jié)果顯示，相對于正常肝組織Lnc-11在肝癌組織中表達水平顯著下調(diào)，與芯片結(jié)果相符。
　　2.通過RACE技術(shù)擴增出Lnc-11的5'端和3'端序列，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分別得到約500bp和400bp大小的片段。經(jīng)過

6、膠回收、連接pGEM(@)-T Easy載體，酶切鑒定，陽性克隆送基因公司測序。測序結(jié)果顯示5'端序列與數(shù)據(jù)庫中注釋的序列一致，3'序列較數(shù)據(jù)庫中注釋的序列少約100bp。
　　3.依據(jù)RACE技術(shù)鑒定出Lnc-11的5'端和3'端序列，設(shè)計引物擴增Lnc-11的全長序列，得到約1700bp的片段，連接于pcDNATM3.1(+)和pcDNATM3.1（-）質(zhì)粒，構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-Lnc11和pcDNATM3.1(-

7、)-Lnc11重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后經(jīng)DNA測序證實其序列以及插入方向正確。
　　4.在肝癌細胞中轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒，QRT-PCR驗證Lnc-11的表達水平上調(diào)約300倍;轉(zhuǎn)染24小時候進行功能實驗，劃痕實驗的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒的細胞，較轉(zhuǎn)染空載體的細胞和轉(zhuǎn)染Lnc-11反義序列的重組質(zhì)粒的細胞爬行的能力顯著將降低;Traswell遷移實驗的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒的細胞較兩組對照細胞遷移的能

8、力顯著下降;而增殖實驗的結(jié)果顯示，Lnc11對肝癌細胞的增殖能力無顯著影響。
　　結(jié)論:
　　與正常肝組織相比Lnc-11在肝癌組織標(biāo)本中表達量顯著下調(diào)，與前期非編碼RNA芯片所得結(jié)果相符;并通過RACE技術(shù)鑒定出Lnc-11的5'和3'序列，并成功擴增出Lnc-11的全長序列，并構(gòu)建pcDNATM3.1(+)-Lnc11和pcDNATM3.1(-)-Lnc11重組質(zhì)粒;通過轉(zhuǎn)染Lnc-11的重組質(zhì)粒，上調(diào)肝癌細胞中Lnc-